担持脂質二重膜上におけるNK細胞免疫学的シナプス形成の超解像イメージング

要約

出典:Zheng, P., et al.ガラス支持平面脂質二重膜上のナチュラルキラー細胞免疫学的シナプスの超解像イメージング。 J. Vis. Exp. (2015年)。

このビデオは、支持脂質二重膜(SLB)上のナチュラルキラー(NK)細胞における免疫学的シナプスの形成を視覚化する技術を示しています。SLBは、最初に蛍光色素でタグ付けされたNK細胞活性化受容体リガンドで標識され、続いてNK細胞とインキュベートされます。続いて、重合アクチンおよびパーフォリン陽性溶解顆粒について細胞を染色します。このアプローチにより、STED(Stimulated Emission Depletion)顕微鏡を用いてシナプス形成を可視化することができます。

プロトコル

1. リポソームの調製

1. 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)および1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-キャップビオチニル(ビオチン-PE)のクロロホルム懸濁液の量を計算して、目的の最終濃度で希釈したストックを作成します。400 μM DOPC と 80 μM のビオチン-PE リン脂質をそれぞれ 10 ml で最終濃度にするには、まず 629 μl の 10 mg/ml DOPC と 88 μl の 10 mg/ml ビオチン-PE を別々のガラス製クロマトグラフィーチューブに入れます
   注:DOPCとビオチン-PEのクロロホルム懸濁液を移送しながら、洗浄液(1 L 95%エタノールを60 gの水酸化カリウムを含む120 mlの水、KOH)で洗浄することにより、ガラスハミルトンシリンジとガラスクロマトグラフィーチューブを洗浄することが重要です。.
2. ケミカルフード内でアルゴンの流れでクロロホルムを乾燥させます。クロマトグラフィーチューブをパラフィルムで密封します。
3. 新たに乾燥させたリポソームを凍結乾燥機で一晩(O / N)高真空にさらし、残留クロロホルムを除去します。同日完了の場合は、60〜90分間乾燥させます。
4. 凍結乾燥機が作動している間に、希釈バッファーを調製します。このプロトコルでは、25 mM Tris、pH 8.0からなる25 mLを調製します。150 mM NaCl;および2%(重量による)n-オクチル-β-D-グルコピラノシド(OG)界面活性剤。最初に最初の2つの材料を混ぜ合わせてから、酸素をアルゴンで置き換えてから、乾燥したOGパウダーを追加します。調製後、OG溶液を0.2ミクロンの酢酸セルロースメンブレンでろ過し、4°Cで保存します。
5. さらに、1Lのトリス生理食塩水緩衝液を同じ濃度でOGなしでスクリュートップボトル2本調製します。蒸留水で洗浄したマグネチックスターバーをそれぞれの底に置きます。トリス生理食塩水バッファーを追加で6リットル調製します。アルゴンですべてのボトルから酸素を取り除き、それらも4°Cに置きます。
6. 凍結乾燥後、乾燥脂質をトリス生理食塩水OGバッファーに溶解して、それぞれ4 mMの溶液を調製します。例の体積に従って、DOPCチューブに2 ml、ビオチン-PEチューブに0.2 mlを追加します。
7. ビオチン-PE脂質とDOPC脂質を混ぜ合わせます。これにより、結合したビオチンがリン酸ヘッド基の流動性を損なう可能性があるため、SLBの移動性が向上します。最終濃度を80 μM Biotin-PEにするには、0.2 mLの4 mM Biotin-PEと1 mLの4 mM DOPCを混合します。次に、8.8 mLのTris-生理食塩水OGバッファーを追加します。
8. 最終濃度を400 μM DOPCにするには、4 mM DOPC1 mLとTris-saline OG9 mLを単純に混合します。
9. ソニケーターに氷水を入れます。希釈したリン脂質を含むガラス管をユーティリティクランプを使用して、ソニケーターの中央に置きます。溶液が透明になるまで、希釈したリン脂質を10分間超音波処理します
   手記： ソニケーションは熱を発生するので、温度を低く保つためにソニケーターウォーターバスに氷を追加します。
10. チューブにアルゴンを充填して、空気中の酸素を液体に置換し、パラフィルムで密封します。

2. リポソームの透析

1. 適切な長さ(この例では40cm)の乾式透析チューブ(分子量カットオフ:12-14,000、直径:6.4mm)を、リン脂質希釈液ごとに1つずつ、ロールから切り取ります。
2. ガラスビーカーの蒸留水200mlに2分間浸すことにより、チューブセクションを再水和します。
3. これを高い設定で5分間、または少なくとも水が沸騰するまで電子レンジ
で加熱します。
4. 各チューブの一方の端に結び目を作り、数ミリリットルのトリス生理食塩水OGバッファーで内部を洗い流します。その後、この洗浄バッファーをできるだけ細心の注意を払って絞り出し、内部に残るバッファーの量を最小限に抑えます。
5. 層流フードで、希釈したリン脂質を各チューブに加え、開放端を小さな透析チューブクロージャーでクランプして、すべての空気を排除します。完全な空気排除には、「ウォーターライン」より下にクランプすることにより、少量のサンプルを犠牲にする必要があります。
6. OGを含まないトリス生理食塩水緩衝液の以前に調製したボトルにサンプルを浸します。ボトル内の酸素をアルゴンで置換してから再密封し、O/Nを4°Cで攪拌します。
7. チューブをOGなしの新しいトリス生理食塩水バッファーの新しいボトルに12時間ごとに少なくとも3回移します。
8. 透析した脂質を除去する直前に、酸素を置換するためにそれぞれにアルゴンを充填することにより、脂質を分注するためのいくつかの小さなチューブを準備します。
9. 36時間後、透析ボトルを層流フードに取り込み、透析チューブをボトルから取り外します。濡れた流出水を集めるために、ベンチおむつまたはビーカーを手元に用意してください。
10. クリップの上の透析チューブを切断し、クリップを取り外し、透析した脂質溶液をピペットで氷上にアルゴンガスを充填した準備済みのチューブ内の1 mLアリコートに慎重に移します。
11. リポソーム水溶液を分注し、アルゴンストリームを使用して各チューブ内の酸素を再び置換します。
12. リポソームは4°Cで保存します。凍結しないでください。

3. ヒトNK細胞の単離と培養

1. 15 mlの末梢血またはバフィーコートを50 mlの円錐形チューブに分注します。.この血液を、1%のウシ胎児血清(FBS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1:1の比率で希釈します。
2. 10 mLの血清ピペットで13 mlのFicollをチューブの底に穏やかに加えます。.
3. このチューブを1,200 x gで20分間遠心分離し、加速器とブレークオフを使用するか、最も低い設定で遠心分離します。
4. 遠心分離後、血清学的ピペットを使用して、末梢血単核細胞(PBMC)の浮遊する濁った白い中間層を収集します。これは、透明な黄色の上層とより曇った淡い色の下層との間の交点であり、どちらも赤血球(RBC)の最下層の上にあります。注意: PBMCの収集では、RBCを収集しないでください。
5. 回収したPBMCを新しい50mlのコニカルチューブに入れ、1%FBSを含むPBSで容量まで希釈します。再び遠心分離し、今度はブレーキとアクセルを最大にして、300 x gで5分間
遠心分離します。
6. 上清を捨て、1% FBSを含むPBS10 mLに細胞を再懸濁します。
7. ステップ3.6と同じ設定でもう一度遠心分離しながら細胞をカウントします。
8. 上清を再度捨て、細胞をR10培地に1,000万細胞/mLの密度で再懸濁します。
9. 5 mLのポリスチレンチューブに3,000万個の細胞を採取し、製造元の指示に従って磁気分離キットを使用してNK細胞を単離します。単離後、細胞をさらに1つ数え、R10完全培地(88%ロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地、RPMI、10%FBS、1%N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸、HEPES、1%ピルビン酸ナトリウム)にIL-2(100 U / ml)を添加したR10完全培地に500,000細胞/ mlの密度で再懸濁します。CO₂インキュベーターで37°で培養し、培地を週に2〜3回交換します。

4. ガラス担持平面脂質二重膜の組み立て

1. ビーカーで30%過酸化水素と硫酸を1:3の割合で混合することにより、100mlのピラニア溶液を調製します.
   手記：常に、適切に指定された化学ドラフト内で硫酸などの有害物質を使用して作業してください。
2. この溶液に、2つの長方形の#1.5カバースリップをピラニア溶液に20〜30分間浸します
   手記：カバースリップはピラニア溶液で清掃することが不可欠です。
3. カバーガラスを洗浄している間に、あらかじめ調製した400 μM DOPC脂質を1本、80 μMビオチン-PE脂質を1本取ります。氷上でアルゴンタンクに運びます。
4. 新しい微量遠心チューブ内の酸素をアルゴンで置換し、DOPCとビオチン-PEを1:1の比率で添加します。比容量は実験の必要性によって異なりますが、それぞれ最低2μlにする必要があります。混合物チューブ内の酸素を再びアルゴンガスで置換し、個々の試薬チューブも置換してから、アルゴンガスを冷蔵庫に戻します。
5. 清掃が終了したら、カバーガラスを蒸留水で十分にすすいでください。カバースリップを数分間風乾させます。
6. ステップ5.4で調製したリポソーム混合物1.5 μlを取り出し、チャンバースライドのレーンチャンバーの1つに1滴で分注します。レーンごとに2ドロップを使用するのが一般的ですが、必須ではありません。
7. 乾いたカバースリップを液滴の上にすばやく効率的に置きます。カバーガラスを置いたときに液滴が合流しないように、液滴が十分に間隔を空けていることを確認してください。さらに、液滴がチャンバーの壁の端に触れることなく、円形で明確に保たれていることを確認してください。各レーンの間と周囲をしっかりと押し下げて、カバースリップとスライドの間に水密シールを確保します。
8. マーカーペンを使用して液滴の位置をマークします。
9. 5%カゼイン水溶液100μlをチャンバーに通し、二重層をブロックします。フローチャンバーに気泡がないことを確認してください。
10. 100 μlのストレプトアビジンを333 ng/mlの濃度で各レーンに注入します。室温(RT)で10〜15分間インキュベートします。その後、3 mlのHEPES緩衝生理食塩水(HBS)/ 1%ヒト血清アルブミン(HSA)を各レーンに流して洗浄し、余分なストレプタビジンを取り除きます。.
11. Alexa Fluor 568などのビオチン化蛍光標識抗CD16を、以前に最も効果的であると判断されたタンパク質濃度で100 μl加えます。暗闇で20〜30分間インキュベートします。各レーンに3mlのHBS/1%HSAを流して再度洗浄します。
12. 100 μlのD-ビオチンを25 nMの濃度でチャンバー内に流し、過剰なストレプトアビジンを結合させ、ストレプトアビジンが細胞に非特異的に結合する可能性を排除します。
13. NK細胞をカウントし、HBS/1% HSAに500,000/mLの濃度で再懸濁します。
14. 細胞をスピンダウンしながら、D-ビオチンをチャンバーから洗い流し、レーンごとにさらに3 mlのHBS/1% HSAを注入します。
15. NK細胞を添加する前に、全反射蛍光(TIRF)または共焦点顕微鏡法で光退色後の蛍光回収(光退色後の蛍光回収、FRAP)により、SLB上のリガンドの移動度を確認してください。
16. 細胞の回転が終了し、希望の濃度で再懸濁されたら、各レーンに100 μlを加えます。
17. チャンバーを37°5%_CO2インキュベーターに30〜60分間置きます。
18. このインキュベーション期間の後、細胞を4%パラホルムアルデヒドでRTで10〜20分間固定し、各レーンに3mlのPBSを流してパラホルムアルデヒドを除去して洗浄します。
19. 400 μLのブロッキングバッファー(5%正常ロバ血清および0.2%Triton X-100 in PBS)を添加します。室温で30分間インキュベートします。
20. 希釈した蛍光標識ファロイジン (1 unit/ml 標識ファロイジン) と蛍光標識抗パーフォリンモノクローナル抗体 (500 ng/ml anti-perforin mAb) を 200 μl 加えて、F-アクチンとパーフォリンを染色します。RTで1時間インキュベートします。
21. PBS3mlを流して洗います。チャンバーはイメージングの準備ができています。

>5. STEDを用いた脂質二重膜上のNK Synapseのイメージング

1. 必要なすべてのハードウェアモジュールの電源を入れます。
2. 画像解析ソフトウェアを起動します。レゾナントスキャンモジュールとSTEDモジュールの両方を有効にします。これらの選択を行った後、ソフトウェアが起動するまで約3〜5分待ちます。
3. 画面上部の「設定」タブをクリックします。
4. 「Laser Config」を選択し、白色光とSTED 592 nmレーザーをオンにします。
5. 100倍対物レンズを選択し、励起レーザービームを592nmの空乏レーザーに合わせます。
6. 「Laser Config」モジュールを選択し、592 Depletion Laser をオフに、660 nm Depletion Laser をオンにします。
7. スライドをステージのレンズの上に置きます。境界が定められた二重層領域に結合した細胞を、白色光ランプと接眼レンズを使用して焦点を合わせます。
8. 「Configuration」タブのすぐ右側にある「Acquisition」タブに戻ります。
9. 「ホワイトライトに切り替える」タブをクリックし、そのモジュールをオンにして、励起レーザーラインを適切な波長にドラッグします。
10. 使用可能な検出器のリストから目的の検出器を選択し、適切な波長範囲を含むように検出範囲を設定します。
    手記：検出範囲を励起ビームの真下に置かないでください。
11. 左側の「Acquire」ツールバーの「Seqential」ボタンをクリックすると、左側のツールバーの下部にあるSequential Scanningダイアログが表示されます。これにより、ユーザーは複数のシーケンスを追加し、それぞれに異なる色の異なる励起ビームを付けることができます。「Between Frames」をクリックし、手順5.9および5.10のように、追加の各色の励起周波数、検出器、および検出範囲を設定します。
12. すべての設定が最適化されたら、「開始」を押して取得プロセスを開始します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
18:1 (Δ9-CIS) PC (DOPC) 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン	アヴァンティ	850375C	リポソーム調製
18:1ビオチニルキャップPE 1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチニル)(ナトリウム塩)	アヴァンティ	870273C	リポソーム調製
アルゴン・ガス、圧縮	エアガス	UN1006	リポソーム調製
凍結乾燥機	ラブコンコ	フリーゾーン7740020	リポソーム調製
凍結乾燥機チューブ	ラブコンコ	7540200	リポソーム調製
クロマトグラフィーカラム	サンタクルス	SC-205558	リポソーム調製
1 M トリス pH 8.0	アンビオン	AM9856	リポソーム調製
5 M NaCl	アンビオン	AM9759	リポソーム調製
オクチル-β-D-グルコピラノシド	シグマ・アルドリッチ	O1008	リポソーム調製
透析チューブ	スペクトラムラボ	132676	リポソーム調製
96ウェルV底ポリスチレンプレート(未処理)	コーニング	3896	抗体密度の測定
非機能化シリカビーズ	バングス研究所	SS06Nの	抗体密度の測定
FACSチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	14-959-2A	抗体密度の測定
QuantumTM MESFビーズ	バングス研究所	変数	抗体密度の測定
カゼイン	シグマ・アルドリッチ	C0875	脂質二重層の調製
HEPES緩衝生理食塩水+ 1%HSA	ホームメード		脂質二重層の調製
ストレプトアビジン	ライフテクノロジー	434301	脂質二重層の調製
蛍光標識ビオチン化タンパク質	ホームメード		脂質二重層の調製
同上スティッキースライドVI 0.4	同上	80608	脂質二重層の調製
25x75mmガラスカバースリップ	同上	10812	脂質二重層の調製
過酸化水素(30%)	フィッシャーサイエンティック	BP2633	脂質二重層の調製
硫酸	シグマ・アルドリッチ	258105	脂質二重層の調製
D-ビオチン	インビトゲン	B20656	脂質二重層の調製
レンズペーパー	VWRの	54826から001	イメージング用
タイプF浸漬油	ライカ	11 513 859	イメージング用
ライカTCS STED顕微鏡	ライカ		イメージング用