Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Flow Cytometric Analysis 用サンプル調製

要約

出典:McBride, J. E., et al. ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー解析。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、蛍光染色された標的細胞に対するナチュラルキラー細胞の溶解活性を示しています。この手法では、死細胞を染色し、フローサイトメーターを使用して生細胞と死細胞の標的細胞を定量することにより、NK細胞による細胞毒性の測定が可能になります。

プロトコル

1. 制御の準備

1. 以下を、適切にラベル付けされた別々の1.5 mLチューブに移します。
   1. 再懸濁したDiO標識K562細胞を含む新鮮なIMDM500 μLを「Double Positive」標識1.5 mLチューブに加えます。
   2. 再懸濁したDiO標識K562細胞を含む新鮮なIMDM500 μLを、「DiO only」標識1.5 mLチューブに加えます。
   3. 再懸濁した標識されていないK562細胞を含む新鮮なIMDM500 μLを、「ヨウ化プロピジウム(PI)のみ」と標識した1.5 mLチューブに加えます。
2. ダブルポジティブチューブとPI専用チューブを55°Cのウォーターバスに5分間入れます。
3. 5分が経過したら、チューブを取り外し、70%エタノールで拭き取ります。
4. 10 L の PI をダブルポジティブチューブに加え、PI チューブは 1.5 mL のみです。
5. 3つのK562ターゲットセルコントロールすべてをインキュベーターに37°Cで30分間置く。
6. 30分間のインキュベーションが経過した後、3つのK562ターゲットセルコントロールすべてを163 x gで2分間遠心分離します。
7. 細胞ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
8. 各コントロールを20 μLの新鮮なIMDM細胞培養培地で再懸濁し、5% CO₂を入れた37°Cインキュベーターに少なくとも30分間放置して、最適なDiOシグナルを得ます
   手記：これで、コントロールをイメージングフローサイトメーターに通す準備が整いました。

>2. 細胞毒性アッセイサンプル調製

1. それに応じて、各サンプル/参加者に1.5 mLチューブを準備し、標識します。
2. ピペットは、各チューブ内のNK細胞とDiO標識K562細胞の比率を求めました
   注:例えば、K562ターゲット細胞とNKエフェクター細胞の所望の比率は1:5です。
3. 135 x gで5分間遠心分離します。
4. 細胞ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
5. インターロイキン-2(IL-2)および2-メルカプトエタノール(2-ME)(不完全なNK細胞培養培地)を含まないNK細胞培地500μLにNK-DiO標識K562細胞混合物を再懸濁します
   注:不完全なNK細胞培養培地は、L-グルタミン、リボヌクレオシド、およびデオキシリボヌクレオシドを含まない、重炭酸ナトリウムを含むMinimum Essential Medium Eagleです。
6. 各チューブに5 μLのPIを加えます。
7. 163 x gで2分間遠心分離します。
8. 細胞を37°Cで2時間インキュベートします。
9. 2時間のインキュベーション後、163 x gで2分間遠心分離します。
10. 細胞ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
11. 25 μLの不完全なNK細胞培養培地に細胞を再懸濁します。

3. 自発的(「S」)サンプルの準備

1. DiO標識K562細胞(濃度1 x 106細胞/mL)を500 μlで1.5 mLチューブにピペットで
移します。
2. 各チューブに10μLのPIを加えます。
3. 遠心分離チューブを163 x gで2分間遠心分離します。
4. 細胞を37°Cで2時間インキュベートします。
5. 2時間のインキュベーション後、163 x gで2分間遠心分離します。
6. 細胞ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除きます。
7. 細胞を25 μlの不完全なα-minimum Essential Medium (α-MEM) cell culture culture培地に再懸濁します。

>4. イメージングフローサイトメーターによるデータ取得

1. イメージングフローサイトメーターの前面ドアの内側にある緑色のボタンを押して、装置の電源を入れます。
2. イメージングフローサイトメーターに関連付けられているすべてのコンピュータの電源を入れます。
3. イメージングフローサイトメーターソフトウェアを起動します。
4. 「スタートアップ」ボタンをクリックしてシステムをフラッシュし、サンプルラインを準備します。
5. 「スタートアップ」が完了したら、「キャリブレーション」ウィンドウを閉じます。
6. チャンネルの割り当て:左上の各チャンネルをクリックして割り当てます。
7. 右側にある散布図ボタンをクリックして、4つの散布図を作成します:Raw Max Pixel _MC_6対Area_M06、Raw Max Pixel _MC_2対Area_M02、Raw Max Pixel _MC_5対Area_M05、FieldArea_M01対AspectRatio_M01。
8. まず、「ダブルポジティブ」コントロールを使用してサンプルの分析を開始します。
   1. 「ロード」をクリックします。
   2. ステップ 1.4 から 1.8 までの「ダブルポジティブ」サンプルが入った 1.5 ml チューブをサンプルローダーに入れます。
   3. 「倍率」タブで40倍対物レンズを選択します。
   4. 405 mW と 642 mW のレーザーをオンにします。
   5. 「明視野」チャンネルをオンにします。
   6. 「強度を選択」をクリックします。
   7. 「ダブルポジティブ」コントロールサンプルに基づいて、検出器が過負荷にならないように、405 mWレーザーの所望の強度を決定します。
      手記： たとえば、この実験の最適な強度は 11 mW に設定されました。
9. 目的のセットアップが完了したら、データを集録します。
   1. 「ファイル取得」タブで、カスタムファイル名のテキストを入力します。データファイルを保存するフォルダーを選択します。
   2. 「Collect」の横に取得するセルの数を入力します。通常、この数は 1,000 から 10,000 の間で変動します。
   3. 「取得」をクリックします。
      注:必要な数のセルが取得されると、データファイルは以前に選択したフォルダに自動的に保存されます。
10. 集録が終了したら、次のコントロールサンプル(DiOのみのコントロール)をロードします。
    1. 「ロード」をクリックします。
    2. 「DiOのみ」のサンプルが入った1.5 mLチューブをサンプルローダーに入れます。
    3. 「倍率」タブの下の40倍対物レンズを選択したままにします。
    4. 405 mWレーザーはオンのままにします。
    5. 642 mWレーザーと「明視野」チャンネルをオフにします。
       注:目的のセットアップが達成されたので、データを取得できます。
    6. 「ファイル取得」タブで、カスタムファイル名のテキストを入力し、データファイルを保存するフォルダを選択します。「Collect.」の横に取得するセルの数を入力します。通常、この数は 1,000 です。
    7. 「取得」をクリックします。
       手記：必要な数のセルが取得されると、データファイルは以前に選択したフォルダに自動的に保存されます。
11. 「PIのみ」のコントロールサンプルについて、手順4.10を繰り返します。これで、実験サンプルを収集する準備が整いました。
12. 「自発的な「S」サンプルを含む残りの実験サンプルは、次のように取り扱います。
    1. 「倍率」タブの下の40倍対物レンズを選択したままにします。
    2. 405mWおよび642mWレーザーをオンにします。
    3. 「明視野」チャンネルをオンにします。
    4. 「強度の設定」をクリックします。
    5. 「ファイル取得」タブで、カスタムファイル名のテキストを入力し、データファイルを保存するフォルダを選択します。カスタムファイル名のテキストを入力します。
    6. 「収集」の横に取得するセルの数を入力します。
    7. 「取得」ボタンをクリックします.
       手記：必要な数のセルが取得されると、データファイルは以前に選択したフォルダに自動的に保存されます。
13. すべての実験サンプルについて、手順4.12を繰り返します。
14. すべての実験データとファイルが収集されたら、「シャットダウン」ボタンをクリックしてシステムを滅菌します。

5. イメージングフローサイトメーター サンプル解析

1. イメージングフローサイトメーター解析ソフトウェアアプリケーションを開きます。
2. [ファイル] で試験運用版を開きます。RIF ファイル。
3. 1 つの色を使用して新しいマトリックスを作成します。RIFファイル(DiOのみのコントロールおよびPIのみのコントロール、ステップ4.10および4.11で作成)は、イメージングフローサイトメーターソフトウェアのCompensationタブで「Create a New Matrix」を選択して作成してください。
   注:ソフトウェアは、単一カラーファイルの選択を求め、それらをマージしてマトリックスファイル(.ctmファイル拡張子)を作成します。これは、チャネル補正を適用するために選択されます。
4. ソフトウェアの「ビルディングブロック」機能を使用してドットプロットを作成します。
   1. ドットプロット(BrightFieldGradient_RMS対周波数)を作成して、焦点を合わせたセルをゲートします。ゲートを「フォーカス」と呼びます(図1A)。
   2. "Focus" ゲートを使用して、Bright Field Area と Bright Field Aspect Ratio のドット プロットを作成し、一重項セルをゲートします。ゲートを「シングル」と呼びます(図1B)。
   3. 「シングル」ゲートを使用して、Intensity_MC_Ch02 対 Intensity_MC_Ch5 のドットプロットを作成します。このプロットを使用して、DiO 陽性のみの細胞 (ターゲット、生存) と PI-DiO ダブル陽性細胞 (ターゲット、死) を同定し、ゲートします (図 1C).
      手記：ステップ5.4.1、5.4.2、および5.4.3で説明したすべてのプロットは、ソフトウェアの「ビルディングブロック」機能を使用して作成できます。
5. ドットプロットの統計機能をクリックして、各ゲートのセル番号にアクセスします。
6. 自発的サンプルと実験サンプルのデッドターゲットの割合を、次の式を使用して計算します:
   サンプル中のデッドターゲットの割合 = (#dead ターゲット x 100)/(#live ターゲット + #dead ターゲット)
7. 次の式を使用して細胞毒性を計算します:
   % 細胞毒性 = [(実験的死-自然死)/(100-自然死)]×100

結果

図1:細胞毒性活性分析のための代表的なヒストグラム、散布図、および画像。 (a)フォーカスセル解析。(B)シングルセル解析。(C)標的細胞染色分析。すべての決定は、各イベントに添付された画像を使用して行われます。これは、グラフ上のイベントをクリックするだけで、分析ソフトウェアでアクセスできます。(D)アポトーシスNK細胞と生きたK562標的を示すダブレットイベントの代表画像。Ch01、明視野。Ch02、ディオ。Ch05、PI。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
K-562リンパ芽球	ATCCの	CCL-243
Iscoveの変更されたDulbeccoの媒体	ATCCの	2005年30月	高グルコース, L-グルタミン付き, HEPES付き, 滅菌濾過
アルファミニマムエッセンシャルミディアム	ATCCの	CRL-2407	リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシドを含まないが、2 mM L-グルタミンと 1.5 g/L 重炭酸ナトリウムを含む
ヨウ化プロプリジウム染色液	BDファーミンゲン	51-66211Eメール
Vybranto DiO細胞標識ソリューション	ヴィブラント	V-22886
ImageStream X Mark II イメージングフローサイトメーター
全血CD56マイクロビーズ、ヒト	ミルテニーバイオテック	〒130-090-875
ImageStream X Mark II イメージングフローサイトメーター	EMDミリポア
スピードビーズ	株式会社アムニス	400030
INSPIREソフトウェア	EMDミリポア	Version Mark II、2013年9月
アイデアアプリケーションソフトウェア	EMDミリポア		バージョン 6.1、2014 年 7 月