出典: Neuhaus, V. et al., Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices. J. Vis. Exp. (2018)
このビデオでは、孤立した人間の肺をアガロースで膨らませ、人間の精密に切断された肺スライスを準備する手順について説明します。調製したex vivo肺スライスは、さらなる免疫学的実験に使用できます。
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方法論記事
アガロースを用いたヒト精密切断肺スライスの調製
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. ヒトPCLSの一般的な調製とその後の化学物質への曝露
>注:肺を満たすには2人が必要です。A型肝炎およびB型肝炎の最新の予防接種記録が推奨されます。患者は、肺移植の前にHCVとHIVの定期的なスクリーニングを受けます。結核菌による活動性感染症が診断または疑われる場合は、肺を拒絶する必要があります。.それにもかかわらず、すべての新鮮なヒト肺組織とそれに由来するサンプルは、感染の可能性があるものとして扱う必要があり、スタッフの労働安全を確保するために、対応する保護措置(粒子フィルターマスク(FFP2)、保護メガネ、手袋)を講じる必要があります。手続きには60〜90分かかります。
- ヒト肺葉の無傷性を確認します.
手記：胸膜の裂傷は、組織の均質な充填を防ぎます。ヒトの肺物質は、切除日のものでなければなりません。氷上にアガロースを充填する前に、室温(RT)で約2時間の保存期間が許容されます。このプロトコルで使用する組織は、切除を受ける患者から採取されます。亡くなった患者からのものではありません。組織が氷上に保存されている場合は、充填する前にRTに予め温めてください、そうしないと、アガロースはすぐに重合し、均一な充填は不可能です
注意： ネイティブの人間の材料と接触するすべての人が、白衣、2組の手袋、キャップ、フェイスマスク、および安全メガネからなる防護服を着用していることを確認してください。人間の物質は感染する可能性があります。 - 7.5 gの低ゲル化アガロースを秤量し、250 mLの二蒸留水に加えます。アガロースが溶けるまで電子レンジでアガロースを沸騰させます。アガロースの融点とゲル化点に応じて、約40°Cに冷却します.
手記：ローブのサイズに応じて、いくつかのフラスコが必要です。 - 温め、培地(材料表)を37°Cに保ちます
手記：アガロースが熱すぎると、培地中のビタミンが効かなくなり、細胞が損傷を受けます。培地/アガロース溶液の温度が37°C未満の場合、ゲル化プロセスが開始され、肺の均質な充填が損なわれます。37 °C から 39 °C の温度範囲のみが推奨されます。 - 開始する前に、必要なすべての材料を手の届くところに置きます:5〜10個のクランプ、長さ約1 mの柔軟なカテーテル、カテーテルへの接続に適したシリンジ(例:50 mL)、氷で満たされたアイスボックス。
- シリコンチューブを挿入し、チューブと平行な向きのクランプで固定することにより、気管/主気管支をカニューレに注入します。これにより、クランプがシリコンチューブに沿って組織を挟むことなく一緒に圧迫します。シリコンチューブが内部に固定され、充填手順中に滑り落ちないようにします。他のすべての気管支、血管、および怪我をクランプで閉じて、充填手順中にアガロースが漏れないようにします。
- 等量の3%低ゲル化アガロースをビーカー内の培地と混合します。50mLの注射器を使用して混合物を肺に注入します。シリンジに培地を補充する前に、指またはクランプでカテーテルをclで閉じますamp気泡とアガロースの逆流を防ぎます。.肺葉が完全に膨らむまで肺葉を満たします。側面の肺胸膜に注意深く触れます。胸膜は均一で硬い必要があります.
手記：肺葉のサイズにもよりますが、最大2または3Lのアガロース/培地溶液が必要になる場合があります。 - 1つの標本内に複数の気管支がある場合、各気管支について手順1.5〜1.6を繰り返します。
- 点眼されたアガロースの量に応じて、アガロースをゲル化するために肺を氷上に置きます20〜40分間。胸膜のいくつかの側面に注意深く触れて、重合が完了したことを示す硬くて冷えているかどうかを確認し、そうでない場合は待ち続けます。病理医に肺をスライスさせ、サンプルを採取し、輸送のために肺材料を氷の上に保管します。
- 鋭利なナイフで人間の肺組織を3〜5cmのスラブに切ります><。 手記： すべての肺に新しいブレードを使用して、切れ味を確保します。
- ティッシュスライサーに400mLの氷冷したアールバランス塩溶液(EBSS)を入れます。半自動ドライバーと好みの直径(例:.、8 mm; 10 mm)のコアリングツールを使用して、肺スラブから円筒形の組織コアをすぐに切り取ります。.
手記：この直径は、機械内部のティッシュホルダーの直径と等しくなければなりません。 - 肺切片の厚さを希望の厚さの値に調整します。
手記：PCLS実験では、約250μmの厚さが一般的に使用されます。ティッシュスライサーの製造元は、スライスの厚さを確認するためにティッシュスライス厚さ計を推奨しています。あるいは、共焦点顕微鏡と組み合わせたホールマウント染色を使用して、スライスの厚さを決定することもできます。 - ティッシュコアをティッシュスライサーのティッシュホルダーに移します。ティッシュホルダーの一部に重り(ティッシュホルダーの一部)を載せます。ティッシュスライサーでアーム速度とブレード速度を6に設定します。組織コアをPCLSにスライスし始めます。
- 市販のダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)500 mLを補充します:栄養混合物F-12 DMEM / F12(1:1)に5 mLのペニシリン(10,000 units/mL)とストレプトマイシン(10,000 μg / mL)を補給します。.培地は、無菌条件下で冷蔵庫に数日間保存してください。必要な量の培地のみを温めます.
手記：ペニシリンは、37°Cで長期間保持すると不活化されます。血清組成はバッチごとに異なり、フェノールレッドなどの色素はアッセイに干渉する可能性があるため、無血清および無色素の培地を使用してください。 - ペトリ皿(100 x 15 mm)に25 mLの氷冷培地を入れます。培地は、ガラスシリンダーのクランプを開いて、ティッシュスライサーからビーカーに排出する必要があります。ビーカーからシャーレにスライスを、アプリケーター(接種ループなど)を使用して、培養液でペトリ皿に移します。ペトリ皿をインキュベーター(37°C、5%CO2、湿度100%)に入れます。洗浄手順の前に、媒体を温めるのを待ちます.
手記：その後のステップはすべて無菌条件下で行われます。 - PCLSを洗浄するために、セルストレーナーをペトリ皿に入れます。10 mLの血清学的ピペットで培地を細胞ストレーナーから完全に取り出し、37°Cに予熱した新鮮な培地25 mLを加えます。この手順を30分ごとに3〜4回繰り返します
手記：セルストレーナーは、スライスがピペットに吸い込まれるのを防ぎ、スライスの損傷を防ぎます。 - 肺スライスを24ウェル培養プレートに慎重に移し、ウェルあたり2スライス分の最低500μLの培養培地を入れます
手記： 移し替えには、組織が損傷するのを防ぐために、できれば接種ループを使用し、スライスをループに浮かべます。十分な新鮮な培地が不足するだけで組織スライスの細胞死が誘発されるため、スライスのさらなる分離は必要ありません。スライスはウェル内で重なったり、互いに接触したりすることがありますが、これは組織の生存率に影響を与えません。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| シリコンホース 3.0 x 5.0 mm | A.ハルテンシュタイン(ライプツィヒ、ドイツ) | SS04 | |
| 注射器 | Faust Lab Science(ドイツ・クレットガウ) | 9.410 050 | |
| コアリングツール | オーダーメイド | オーダーメイド | |
| トリミングブレードハンドル(フェザー) | pfm medical ag (ドイツ・ケルン) | 205530001 | |
| トリミングブレード(フェザー) | pfm medical ag (ドイツ・ケルン) | 205500000 | |
| ミクロトーム:ティッシュスライサー | アラバマR&D(ドイツ、バート・ホンブルク) | 303400-ADPT | Krumdieckティッシュスライサー(MD6000) |
| ミクロトームブレード | Wilkinson Sword (ゾーリンゲン、ドイツ) | ENR-4027800011506 | |
| 組織培養皿 | Sigma(ドイツ、ミュンヘン) | Z666246-420EA | |
| 接種ループ | Copan Diagnostics(米国、ムリータ) | CD176S01 | |
| TPP組織培養プレート 24ウェル | Sigma(ドイツ、ミュンヘン) | Z707791-126EA | |
| カセット | Thermo Scientific(ドイツ、シュヴェルテ) | 1000957 | |
| Nunc MaxiSorpフラットボトム | Fisher Scientific GmbH (ドイツ、ハノーバー) | 〒44-2404-21 | |
| Nunc MicroWell 96ウェル | Thermo Scientific(ドイツ、シュヴェルテ) | 260836 | |
| 試薬 | |||
| アガロース、低ゲル化温度 | Sigma(ドイツ、ミュンヘン) | A9414-100Gの | |
| バランス塩混合物および溶液, 細胞培養, クラシック培地および塩, アールバランス塩(EBSS) | Sigma(ドイツ、ミュンヘン) | E2888-500ミリリットル | |
| ペニシリンとストレプトマイシン | ロンザ(ベルギー、ヴェルヴィエ) | 17-602E | |
| ダルベッコのモディファイドイーグルの中型栄養素混合物F-12ハム(DMEM F-12) | Gibco (ドイツ、ダルムシュタット) | 〒11039-047 | 培地 |
| CaおよびMgを含むダルベッコリン酸(DPBS) | ロンザ(ベルギー、ヴェルヴィエ) | BE17-513F |
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