サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています
1. ヒトPCLSの一般的な調製とその後の化学物質への曝露
>注:肺を満たすには2人が必要です。A型肝炎およびB型肝炎の最新の予防接種記録が推奨されます。患者は、肺移植の前にHCVとHIVの定期的なスクリーニングを受けます。結核菌による活動性感染症が診断または疑われる場合は、肺を拒絶する必要があります。.それにもかかわらず、すべての新鮮なヒト肺組織とそれに由来するサンプルは、感染の可能性があるものとして扱う必要があり、スタッフの労働安全を確保するために、対応する保護措置(粒子フィルターマスク(FFP2)、保護メガネ、手袋)を講じる必要があります。手続きには60〜90分かかります。
- ヒト肺葉の無傷性を確認します.
手記：胸膜の裂傷は、組織の均質な充填を防ぎます。ヒトの肺物質は、切除日のものでなければなりません。氷上にアガロースを充填する前に、室温(RT)で約2時間の保存期間が許容されます。このプロトコルで使用する組織は、切除を受ける患者から採取されます。亡くなった患者からのものではありません。組織が氷上に保存されている場合は、充填する前にRTに予め温めてください、そうしないと、アガロースはすぐに重合し、均一な充填は不可能です
注意：ネイティブの人間の材料と接触するすべての人が、白衣、2組の手袋、キャップ、フェイスマスク、および安全メガネからなる防護服を着用していることを確認してください。人間の物質は感染する可能性があります。
- 7.5 gの低ゲル化アガロースを秤量し、250 mLの二蒸留水に加えます。アガロースが溶けるまで電子レンジでアガロースを沸騰させます。アガロースの融点とゲル化点に応じて、約40°Cに冷却します.
手記： ローブのサイズに応じて、いくつかのフラスコが必要です。
- 温め、培地(材料表)を37°Cに保ちます
手記： アガロースが熱すぎると、培地中のビタミンが効かなくなり、細胞が損傷を受けます。培地/アガロース溶液の温度が37°C未満の場合、ゲル化プロセスが開始され、肺の均質な充填が損なわれます。37 °C から 39 °C の温度範囲のみが推奨されます。
- 開始する前に、必要なすべての材料を手の届くところに置きます:5〜10個のクランプ、長さ約1 mの柔軟なカテーテル、カテーテルへの接続に適したシリンジ(例:50 mL)、氷で満たされたアイスボックス。
- シリコンチューブを挿入し、チューブと平行な向きのクランプで固定することにより、気管/主気管支をカニューレに注入します。これにより、クランプがシリコンチューブに沿って組織を挟むことなく一緒に圧迫します。シリコンチューブが内部に固定され、充填手順中に滑り落ちないようにします。他のすべての気管支、血管、および怪我をクランプで閉じて、充填手順中にアガロースが漏れないようにします。
- 等量の3%低ゲル化アガロースをビーカー内の培地と混合します。50mLの注射器を使用して混合物を肺に注入します。シリンジに培地を補充する前に、指またはクランプでカテーテルをclで閉じますamp気泡とアガロースの逆流を防ぎます。.肺葉が完全に膨らむまで肺葉を満たします。側面の肺胸膜に注意深く触れます。胸膜は均一で硬い必要があります.
手記： 肺葉のサイズにもよりますが、最大2または3Lのアガロース/培地溶液が必要になる場合があります。
- 1つの標本内に複数の気管支がある場合、各気管支について手順1.5〜1.6を繰り返します。
- 点眼されたアガロースの量に応じて、アガロースをゲル化するために肺を氷上に置きます20〜40分間。胸膜のいくつかの側面に注意深く触れて、重合が完了したことを示す硬くて冷えているかどうかを確認し、そうでない場合は待ち続けます。病理医は肺をスライスに切り、サンプルを採取し、輸送のために肺材料を氷上に保管します。
- 鋭利なナイフで人間の肺組織を3〜5cmのスラブに切ります><。
手記：すべての肺に新しいブレードを使用して、切れ味を確保します。
- ティッシュスライサーに400mLの氷冷したアールバランス塩溶液(EBSS)を入れます。半自動ドライバーと好みの直径(例:.、8 mm; 10 mm)のコアリングツールを使用して、肺スラブから円筒形の組織コアをすぐに切り取ります。.
注意: この直径は、機械内部のティッシュホルダーの直径と等しくなければなりません。
- 肺切片の厚さを希望の厚さの値に調整します。
手記：PCLS実験では、約250μmの厚さが一般的に使用されます。ティッシュスライサーの製造元は、スライスの厚さを確認するためにティッシュスライス厚さ計を推奨しています。あるいは、共焦点顕微鏡と組み合わせたホールマウント染色を使用して、Brismarらが説明したようにスライスの厚さを決定することもできます。27 名
- ティッシュコアをティッシュスライサーのティッシュホルダーに移します。ティッシュホルダーの一部に重り(ティッシュホルダーの一部)を載せます。ティッシュスライサーでアーム速度とブレード速度を6に設定します。組織コアをPCLSにスライスし始めます。
- 市販のダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)500 mLを補充します:栄養混合物F-12 DMEM / F12(1:1)に5 mLのペニシリン(10,000 units/mL)とストレプトマイシン(10,000 μg / mL)を補給します。.培地は、無菌条件下で冷蔵庫に数日間保存してください。必要な量の培地のみを温めます.
手記：ペニシリンは、37°Cで長期間保持すると不活化されます。血清組成はバッチごとに異なり、フェノールレッドなどの色素はアッセイに干渉する可能性があるため、無血清および無色素の培地を使用してください。
- ペトリ皿(100 x 15 mm)に25 mLの氷冷培地を入れます。培地は、ガラスシリンダーのクランプを開いて、ティッシュスライサーからビーカーに排出する必要があります。ビーカーからシャーレにスライスを、アプリケーター(接種ループなど)を使用して、培養液でペトリ皿に移します。ペトリ皿をインキュベーター(37°C、5%CO2、湿度100%)に入れます。洗浄手順の前に、媒体を温めるのを待ちます.
手記：その後のステップはすべて無菌条件下で行われます。
- PCLSを洗浄するために、セルストレーナーをペトリ皿に入れます。10 mLの血清学的ピペットで培地を細胞ストレーナーから完全に取り出し、37°Cに予熱した新鮮な培地25 mLを加えます。この手順を30分ごとに3〜4回繰り返します
手記：セルストレーナーは、スライスがピペットに吸い込まれるのを防ぎ、スライスの損傷を防ぎます。
- 肺スライスを、ウェルあたり2スライス分の最低500 μLの培養培地を入れた24ウェル培養プレートに慎重に移します。肺組織を物質(ステップ3.1〜3.4を参照)に曝露します(手順3.1〜3.4を参照)、たとえば、37°Cで24時間、5%CO2.
手記：移し替えには、組織が損傷するのを防ぐために、できれば接種ループを使用し、スライスをループに浮かべます。十分な新鮮な培地が不足するだけで組織スライスの細胞死が誘発されるため、スライスのさらなる分離は必要ありません。スライスはウェル内で重なったり、互いに接触したりすることがありますが、これは組織の生存率に影響を与えません。
- すべての残留人体材料を固定剤(例:10%緩衝ホルムアルデヒド)を入れたプラスチックフラスコに少なくとも24時間入れ、これを廃棄プロセスで燃焼させます
注意:ホルムアルデヒドは有毒ですので、この手順はフードの下で行ってください。
>2. 物質溶液の調製
>注:使用直前に作業溶液と制御を準備してください。
>注意: 安全指示に従って物質を取り扱うか、不明な場合は潜在的に有害である物質として取り扱い、日常的な安全上の注意に従ってください。
- 水溶性物質を培地に直接溶解します。不溶性または難溶性の化学物質の場合、まず、物質の溶解度に応じて、物質を適切な溶媒に溶解します。水溶性が限られている物質(<0.1 mg/mL)は、DMSOやエタノールなどに溶解できます。無毒の溶媒濃度は、事前に滴定によって決定する必要があります。媒体に希釈したときに物質が溶液から沈殿しないようにしてください.
手記：HClPtおよびラウレス硫酸ナトリウム(SLS)溶液を調製します。
- 培地または溶媒中の所望の最高濃度の100倍の物質ストック溶液を調製します。12.5 mg HClPtと34.4 mg SLSを秤量し、薬品を1 mLの培地に溶解してストック溶液を調製します><。
手記：これらの薬品には溶剤は必要ありません。
- 予め温めた培地で1:100の最終希釈液を調製します。以前に溶媒を使用した場合、このアプローチでは、すべての物質濃度で最終溶媒濃度が同じになります。
- PCLSの参照処理には、最終溶媒濃度(ステップ2.3で説明した1%など)を使用します。結果セクションに記載されている化学物質については、溶媒管理は必要ありませんでした。
3. 細胞毒性アッセイのポジティブおよびネガティブな参考文献
- すべての生存率アッセイについて、以下のポジティブコントロールとネガティブコントロールを調製してください。
- 組織制御:細胞培養条件(37°C、5%CO2、湿度100%)で、未処理のPCLSの基準としてのみ、PCLSを培養培地で24時間インキュベートします。
- ビヒクル制御(必要な場合):ビヒクルのみで処理したPCLSの基準として、最終溶媒濃度をPCLSとインキュベートします(ステップ1.4を参照)細胞培養条件(37°C、5%CO2、湿度100%)で24時間
。
- ポジティブコントロール:PCLSを1%界面活性剤と緩衝液中で4°C.
で1時間インキュベートします。
手記：PCLSが無色になると、組織は死んでいます。総L-乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)は上清中で測定され、吸収は約1.9〜2.3です(ステップ4.1〜4.4を参照)。
4. LDHアッセイ
注:LDHアッセイは、インキュベーション後の期間後に合計100 μLの培養上清を含む96ウェルプレートで実施されます。
- 試験剤の有無にかかわらずPCLSをインキュベートした後、ステップ1.16から50 μLの上清を取り出し、新しい96ウェルプレートに二重に移します。これにより、24ウェルプレートの各処理済みウェルから重複が生成されます。
- アッセイの直前にLDH試薬の作業溶液を調製します。ワーキングソリューションは、触媒溶液(凍結乾燥物を1 mLの二蒸留水に溶解)とメーカーから供給された色素溶液で構成されています。96ウェルプレート1枚につき、125 μLの触媒溶液と6.25 mLの色素溶液を十分に混合します
注意：溶液を直接光にさらさないでください。
- すでに50 μLの上清を含む各ウェルに50 μLの作業溶液をピペットで移し、プレートを暗所の室温で20分間インキュベートします。これ以上の混合は必要ありません。
- マイクロプレートリーダーを使用して、492 nm(参照:630 nm)で各ウェルの吸収を測定します。492nmから630nmでの吸収を差し引きます。これらの値は、手順 3.5.
の計算に使用されます
手記： 細胞毒性評価のための信頼性の高いデータは、生存組織からのみ取得できます。洗剤処理コントロールの吸収は1を超える必要があります。.
- 分析では、ステップ 2.1 のポジティブコントロールの吸収値を 100% に設定し、ポジティブコントロールに対する処理済みサンプルの LDH 放出 (つまり、最大 LDH 放出) を計算します。