免疫調節化合物のスクリーニングのための人工リンパ球を用いた蛍光ベースのアッセイ

要約

出典:Fouda, A., et al., A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. J. Vis. Exp., (2017).

このビデオは、蛍光ベースのアッセイによる免疫調節化合物のスクリーニングを示しています。トランスジェニックマウス由来Tリンパ球に緑色蛍光タンパク質発現カセットを添加したこれらの化合物で処理します。GFPシグナルの増強と減少により、化合物の刺激効果と阻害効果をそれぞれ同定することができます。

プロトコル

>1. 脾細胞培地とフローサイトメトリーバッファーの調製

1. 70%エタノール洗浄された生物学的フードの下ですべてのステップを実行します。
2. 予熱したロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640 1x培地(市販で、ろ過された500 mLの容量の滅菌ボトルで供給)70 mLを取り出し、滅菌チューブに入れます。除去された培地は、プロトコルの後半で使用されます。
3. 残りの 430 mL の RPMI 1640 1x に、50 mL の不活化ウシ胎児血清(FBS)、5 mL ペニシリン/ストレプトマイシン、5 mL N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)、5 mL の非必須アミノ酸、5 mL ピルビン酸ナトリウム、および 0.05 mL のろ過済み (1M) 2-メルカプトエタノール
   を補充します。 手記：細胞に衝撃を与える熱を避けるために、37°Cに設定されたウォーターバスを使用して脾臓細胞培地を温めます。これは、細胞のアポトーシスの誘導を避けるために重要です。
4. フローサイトメトリーバッファーを調製するには、2 mLのFBSを98 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加え、使用するまで(できれば3日以内に)冷蔵保存します。

2. Nur77

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Nur77GFPマウス	ジャクソン研究所	マウス系統No.016617	私たちの動物施設に家のコロニーが設立されました
96ウェル-U培養プレート、滅菌済み	VWRインターナショナル	10062-902	磁気ビーズを用いたT細胞の活性化
70μmセルストレーナー、滅菌済み	コーニング株式会社	352350	脾細胞細胞懸濁液の生成
ポリスチレン丸底チューブ5ml、滅菌済み	コーニング株式会社	352058	脾細胞細胞懸濁液の生成
50 mlポリプロピレン円錐底チューブ、滅菌済み	VWRインターナショナル	89039-656	脾細胞細胞懸濁液の生成
10 mlシリンジ、針なし、滅菌済み	ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー	305482	脾臓をつぶすには
5 mL細胞培養皿、滅菌済み	グライナーバイオワン	627 160	脾臓をつぶすには
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U / mL)	WISENT株式会社	450-200-EL	脾細胞培地の成分
RPMI 1600 と重炭酸ナトリウムと L- グルタミン	WISENT株式会社	350-002-CL	脾細胞培地の成分
MEM非必須アミノ酸	WISENT株式会社	321-010-EL	脾細胞培地の成分
HEPES遊離酸1 M	WISENT株式会社	330-050-EL	脾細胞培地の成分
ピルビン酸ナトリウム溶液(100mM)	WISENT株式会社	600-110-EL	脾細胞培地の成分
ウシ胎児血清(FBS)	WISENT株式会社	〒080-910	脾細胞培地およびフローサイトメトリーバッファーの成分
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	WISENT株式会社	311-010-CL	フローサイトメトリーバッファーの成分
2-メルカプトエタノール (55mM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21985年023月	脾細胞培地の成分
T-細胞単離キット	ステムセルテクノロジー	19851	T細胞を単離するには
マウスT-アクチベーターCD3/CD28超常磁性ビーズ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11452D	T細胞を活性化するには
細胞分離磁石	ステムセルテクノロジー	18000	T細胞を単離し、磁気ビーズを除去するには
組換えマウスIL-7	ペプロテック	217-17	活性化中のT細胞の生存をサポートするため
抗マウスCD3抗体	BDファーミンゲン	561799	フローサイトメトリーのためのT細胞の染色
バイオメッドFXp	パーキンエルマー株式会社	A31842 (英語)	24時間のインキュベーション後に細胞を再懸濁するには
オペラフェニックスハイコンテントスクリーニングシステム	パーキンエルマー株式会社	HH14000000	GFP/Hoechstシグナルの解析

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