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>1. 脾細胞培地とフローサイトメトリーバッファーの調製
- 70%エタノール洗浄された生物学的フードの下ですべてのステップを実行します。
- 予熱したロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640 1x培地(市販で、ろ過された500 mLの容量の滅菌ボトルで供給)70 mLを取り出し、滅菌チューブに入れます。除去された培地は、プロトコルの後半で使用されます。
- 残りの 430 mL の RPMI 1640 1x に、50 mL の不活化ウシ胎児血清(FBS)、5 mL ペニシリン/ストレプトマイシン、5 mL N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N-2-エタンスルホン酸(HEPES)、5 mL の非必須アミノ酸、5 mL ピルビン酸ナトリウム、および 0.05 mL のろ過済み (1M) 2-メルカプトエタノール
を補充します。
手記：細胞に衝撃を与える熱を避けるために、37°Cに設定されたウォーターバスを使用して脾臓細胞培地を温めます。これは、細胞のアポトーシスの誘導を避けるために重要です。
- フローサイトメトリーバッファーを調製するには、2 mLのFBSを98 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加え、使用するまで(できれば3日以内に)冷蔵保存します。
2. Nur77GFPマウス脾臓からの脾細胞懸濁液の生成
- 6〜8週齢の雌Nur77GFPマウスから脾臓を無菌的に分離します。
- これを達成するには、滅菌フードの下で作業します。犠牲にしたマウスの毛皮、はさみ、鉗子を70%エタノールに浸します。
- マウスを右側に置き、左上腹部の皮膚と筋肉を切断します。切開部を検査して脾臓を目に見える形で特定し、それを切り取ります。次のステップを実行する準備ができるまで、脾臓を氷上の脾細胞培地に保管します。
- 脾臓を、5 mLの予熱した脾細胞培地を含む10 cm2細胞培養シャーレに入れます。
- 滅菌シリンジプランジャーを使用して、溶液が濁るまで脾臓をつぶします。脾臓コラーゲンマトリックスは、手順の終わりまでに残るはずです。
- 脾細胞培地で広範囲にマッシュした後、細胞懸濁液を回収し、50 mLチューブ上に置いた70 μmの細胞ストレーナーに通して、破片や血栓をろ過します。
- 500 x gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、細胞ペレットを2〜3 mLの自社製または市販の赤血球溶解緩衝液に再懸濁します。ピペッティング(2〜3回)した後、懸濁液を20〜30秒間休ませます。
- 5 mLのPBSまたは任意の適切なバッファーを加え、細胞懸濁液を500 x gで5分間遠心分離します。
- 上清(溶解した赤血球が含まれているため、色は赤である必要があります)を取り除き、細胞ペレットを2 mlの脾細胞培地に再懸濁します。
- 血球計算盤を使用して、トリパンブルーで染色された細胞の数をカウントし、生細胞と死細胞(壊死)細胞を区別します。
>3. 脾細胞懸濁液からのT細胞の単離
- 細胞懸濁液を500 x gで5分間遠心分離します。 細胞を無血清RPMI培地(ステップ1.3から50 mL)に再懸濁して、細胞濃度10 x 106細胞/mLを得ます。
- 細胞を5 mLのポリスチレンチューブに移し、精製ステップの最後に純度評価/比較のために脾細胞の100 μLアリコートを確保します。
- 正常ラット血清を細胞懸濁液に50 μL/mLで加えた後、T細胞単離抗体カクテル(50 μL/mL)を加えます。
- 細胞懸濁液を混合し、10分間休ませます。このステップにより、抗体カクテルはすべての不要な細胞に結合することができます。
- ストレプトアビジン迅速球(磁気ビーズ)を2.5分間加え、無血清培地を使用して容量を2.5mLにします。.
- チューブを細胞分離磁石に3分間置きます。
- 磁石を保持し、溶液を1回で注ぎ出すことにより、T細胞懸濁液を新しいポリスチレンチューブに移します
手記：単離された懸濁液には、精製されたT細胞が含まれています。すべての不要な細胞は、磁性ストレプトアビジンビーズに結合したチューブの側面に保持されます。
- トリパンブルーと血球計算盤を使用して単離されたT細胞を数えます.
手記：このステップでは、T細胞単離の前後のCD3+イベントの割合をフローサイトメトリーで分析することにより、単離されたT細胞の純度を検証できます(オプション)。
- 簡単に言えば、1 mLの脾臓細胞懸濁液を500 x gで遠心分離します。上清を捨て、細胞をフローサイトメトリーバッファーに1 x 106細胞/mLの濃度で懸濁します。
- 蛍光標識付き抗マウスCD3抗体を1:100の濃度で添加します。4°Cで30分間インキュベートします。一度洗浄し、遠心分離し、フローサイトメトリーバッファー(400 μL)に再懸濁して、フローサイトメトリーによる解析を行います。
>4. T細胞の活性化と緑色蛍光タンパク質(GFP)発現の誘導
- T細胞を懸濁液中で、2.5 x 105細胞/ウェルの濃度で丸底の96ウェルプレートに播種します。
- 組換えインターロイキン(IL)-7を2 ng/mLで添加し、CD3/CD28磁気ビーズ(25 μL/106細胞)を添加します。T細胞の一部をビーズで未処理にして、非活性化T細胞を表す後の測定のネガティブコントロールとして使用します。
- 12時間後、各ウェルの細胞懸濁液を上下に静かにピペッティングして、ビーズ細胞複合体/凝集体を切断することにより、96ウェルプレートからT細胞を回収します。すべてのウェルからの懸濁液を5mLのポリスチレンチューブに集めます。
- 懸濁液を含むチューブを、以前にT細胞の精製に使用したのと同じ細胞分離磁石の中に入れ、5分間休ませます。
- 磁石を保持し、1回の移動で溶液を注ぐことにより、T細胞懸濁液を新しいポリスチレンチューブに移します。
- 細胞を500 x gで5分間遠心分離し、新鮮な脾細胞培地で細胞を再懸濁して、2 x 106細胞/ mLの濃度を得ます。
- 刺激後12〜24時間でのフローサイトメトリー(品質管理のためのオプション)によるGFP発現強度を、非活性化T細胞と比較して評価します。12
手記：GFP蛍光はNur77GFP T細胞に固有のものであり、T細胞受容体TCRの活性化が成功すると現れます。
- 顕微鏡法による生存率および活性化の評価(オプション)のために、0.2 μg/mlの濃度で分析の30分前にHoechstで活性化細胞を染色します。カバースライドまたは平底の黒面384ウェルプレートのウェルに適切な量の細胞懸濁液を加え、蛍光顕微鏡で観察して生細胞を評価します。死んだ細胞は核染色を保持しません。
5. 低分子のハイスループットスクリーニング(HTS)
- 活性化T細胞(磁気ビーズまたは抗体/ CD40L)または非活性化基の2 x 106細胞/ mLで細胞懸濁液を調製します。
- 75,000細胞/ウェルを384ウェルプレート(容量40 μL)にプレートします。蛍光顕微鏡による生存率および活性化評価(HTSの前のオプションの品質管理ステップ)には、平底の黒面384ウェルプレートまたは顕微鏡カバースライドを使用します(詳細については、ステップ4.8を参照)。
- 手動または自動システムを使用して、選択した薬剤(0.5%ジメチルスルホキシド、DMSO)を各ウェルに加えます。
- ビヒクル(DMSO)をポジティブ(活性化)およびネガティブ(非活性化)制御ウェルに追加します。DMSO濃度を最大0.5%に調整します。
- プレートを37°Cおよび5%二酸化炭素、CO2で24時間(または選択したインキュベーション時間)インキュベー
トします。
- スクリーニング当日に、Hoechst 33342染色液を希釈します(1:3,333;例:384ウェルプレートの細胞に10 μLを加えると、総容量が50 μLになります)。GFP分析の30分前にHoechst溶液を添加して染色し、0.2 μg/mLの濃度にします。
- 細胞を静かに上下にピペットで動かして、各ウェルに均一な分布を得ます.
手記：このステップは、自動システムを使用して薬剤を分注する場合(ステップ5.3)に重要であり、細胞は流れの方向とは逆のウェルの片側に蓄積する傾向があります。
- プレートを45 x gで室温で3分間回転させます。
- プレートを室温で15分間休ませます。
- 自動共焦点ハイコンテントスクリーニング(HCS)システムを使用して、プレートの読み出しを行い、プレートを機械にロードします。対物レンズを40倍以上の倍率に設定します。Hoechst(UVランプ)にはカメラ#4を、GFP(レーザー488)にはカメラ#1を使用します。ウェルごとに6〜10フィールドを読み取るようにマシンを設定します。488 nm(GFPを読み取るため)とUV光(Hoechstを読み取るため)でフィールドごとに2つの連続読み取りを行うようにマシンを調整します。対物レンズを40倍以上の倍率に設定してください。
手記：このシステムは、調整を必要としないコンピューター化された顕微鏡です。焦点距離、入射光の強度、露光時間はすべて機械によって自動的に設定されます。