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人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。
1. 楽器のセットアップ
>注:浮遊セルをイメージングするには、Z軸上に磁化された2つの希土類ネオジム磁石を同じ極を向かい合わせに配置して磁場を生成する必要があります。磁石間の距離は、磁場の強度とターゲットの密度に応じてカスタマイズできます。この場合、磁石は、長さ50mmの1x1mm角のガラスキャピラリーチューブを挿入するのに十分な1mmのスペースで区切られています。このデバイスは、リクエストに応じて利用可能なAutoCADデザインを使用して3Dプリントされました。
- 顕微鏡を横向きに置き、完全に水平にします.
手記：標準的な直立位置に置かれた顕微鏡は、コンデンサーと対物レンズに対する磁石の位置により、浮遊物体のイメージングには直接適していません。この制限は、顕微鏡を横向きにして完全に水平にすることで回避でき、コンデンサーは光をキャピラリーに集中させ、対物レンズは磁石の間に浮遊するセルを画像化することができます。
- ブレッドボードテーブルの上でスタンドを支え、水平にします。2つまたは3つのラボジャッキを使用します。
- 振動を制限するには、ブレッドボードテーブルをゴム製のdで支えますamp脚。
- ステージを取り外し、浮上装置の高さ(y軸)を調整するためのコンパクトなラボジャッキと、フォーカス(z軸)を調整するための2つの単軸並進ステージ、およびキャピラリーチューブのスキャン用の2つのステージと交換します。
- 2つのミニシリーズ光学ポストを使用して、磁気浮上装置をラボジャックに取り付けます。
2. カルボキシ微粒子/ビーズへの抗体の結合 (PolyAnによるプロトコールから改変)
>注:アカゲザル、Rh(+)の検出には低密度ビーズ(1.05 g / mL)のみをコーティングする必要がありますが、細胞外小胞の検出には高密度ビーズと低密度ビーズの両方がコーティングされています。
- 1 mg相当のビーズ懸濁液を取り出し、0.5 mLの活性化バッファー(50 mM 2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸、MES(MW195.2、9.72 mg in 1 mL)) pH 5.0および0.001% Polysorbate-20)に加えます。
- 作りたての1.5 M 1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(EDC)12 μL(MW 191.7、0.28755 g、1 mL)と12 μLの0.3 M Sulfo-N-Hydroxysuccinimide(NHS)(MW 217.14、0.0651 g、1 mL)を氷冷水に加えます。
- オービタルシェーカーにチューブを載せ、室温で1時間激しく振とうすると、ビーズ上のカルボキシル基が活性化されます。
- 1時間後にカップリングバッファー(10倍リン酸緩衝生理食塩水、PBS、または0.1 Mリン酸pH 7-9)を添加して活性化を停止します。
- 20,000 x gで10分間遠心分離してビーズをペレット化するか、ビーズをペレット化できない場合は、0.45 μmの遠心分離チューブフィルターを使用します。上清またはフロースルーを吸引します。
- ステップ2.5と同様に、1mLの10x PBSでビーズを3回洗浄します。
- 1 mg ビーズあたり 25 μg の抗体を計算し、目的の抗体と活性化ビーズを混合して、10X PBS で最終抗体濃度 0.7-1.0 mg/mL にします。
- 低速にセットされたチューブロッカーにチューブを置きます。チューブを室温で一晩静かに転がして結合します。
- ステップ2.5を繰り返し、ビーズを10x PBS1 mLで2回洗浄します。
- 0.5 mLの1 Mエタノールアミン(98%ストック= 16.2 M)を緩衝液pH 8.0、0.02%ポリソルベート-20、室温で1時間、穏やかに振とうしながら洗浄します。
- ステップ2.5を繰り返し、ビーズを1 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で1回洗浄します。ビーズは、必要になるまで4°Cで200μLのDPBSに保存できます。
手記：ここでプロトコルを一時停止できます。
3. Rh(+)検出のための血液の採取と調製
- ワンクリック穿刺器具を使用して、Rh(+)ドナーの指を刺し、10μLの血液を1mLのDPBSに採取します。
- Rh+細胞を蛍光原形質膜染色液で染色します。オプションで、Rh+細胞の1 mL懸濁液(1:1000希釈)に1 μLの蛍光色素を添加します。
- 細胞を蛍光色素と37°Cで15分間インキュベー
トします。
- 細胞を5,600 x gで15秒間回転させてペレット化し、1 mLのDPBSを使用して3回洗浄します。カルシウムとマグネシウム(HBSS++)を含むハンクス平衡塩溶液(HBSS)1 mLに再懸濁します。
- ワンクリック穿刺器具を使用して、Rh(-)ドナーの指を刺し、2μLの血液を採取します
手記：2つ以上の条件を調製する場合は、各チューブに1μLのRh(-)血液を追加するのに十分な血液を採取してください。
- 必要な実験チューブを準備します:ビーズのみ、免疫グロブリンG(IgG)コントロール、サンプル。
- ビーズのみ:HBSS++174 μL、IgGコントロールビーズ1 μL、高密度ビーズ1 μL(1.2 g/mL)、500 mM Gd3+(60 mM)24 μLを添加します。
- IgGコントロール:HBSS++172μL、IgGコントロールビーズ1μL、高密度ビーズ1μL、Rh-血液1μL、染色Rh+血液懸濁液1μL、500mM Gd3+24μLを添加します。
- サンプルチューブに 172 μL の HBSS++、1 μL の抗 RhD コーティングビーズ、1 μL の高密度ビーズ、1 μL の Rh- 血液、1 μL の染色済み Rh(+) 血液懸濁液、および 24 μL の 500 mM Gd3+.
を添加します
手記：参照のためにRhサンプルに高密度ビーズを添加します。
4. 磁気浮上装置上の細胞の解析
- 製造元の指示に従って機器を起動します。
- 50 μLのサンプルをキャピラリーチューブにロードし、チューブが満たされるまで待ちます。キャピラリーチューブの端をキャピラリーシーラントでシールし、気泡が存在しないことを確認します。
- キャピラリーチューブを上部と下部の磁石の間のホルダーにロードします。最適な表示のためにステージとフォーカスを調整します.
手記：細胞/ビーズは、その密度とGd3+の濃度に基づいて、磁気平衡位置に到達するのに5〜20分かかる場合があります。Gd3+の濃度が高いほど、時間は短くなります。