T細胞と支持された平面脂質二重膜との相互作用を研究するためのIn Vitro技術

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 画像解析のためのCD4⁺ T細胞の単離

1. 採取したサンプルから10⁷個の凍結末梢血単核細胞(PBMC)またはリンパ節単核細胞(LNMC)を含む1 mLアリコートを解凍します。滅菌フードで、解凍した細胞をペニシリン/ストレプトマイシンとグルタミンを添加したRPMI9mLに加えます。.
   1. 細胞を300 x g、4°Cで10分間遠心分離し、上清を吸引し、10% FBSを含む5 mLのRPMIを補充した(完全培地)に細胞を再懸濁します。細胞を_CO2インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。
2. 翌日、製造元の指示に従って、市販のキットを使用して陰性免疫磁気選別によりCD4⁺ T細胞を精製します。
3. 新たに精製したCD4⁺ T細胞の数を測定するには、5 μLの細胞懸濁液を等量のトリパンブルー溶液と混合します。細胞-トリパンブルー混合物を血球計算盤にロードし、血球計算盤の5つのセクション内の生細胞をカウントします。
4. 細胞数の平均を取り、元の細胞懸濁液中の細胞数を決定します:細胞数/ 1mL =平均カウントx 2 x 10⁴。単離されたセルの総数が少なすぎる場合は、カウントせずにセルをそのまま使用します。
5. 細胞を300 x gで10分間遠心分離し、アッセイバッファー(20 mM HEPES、pH 7.4、137 mM NaCl、2 mM Na₂HPO₄、5 mM D-グルコース、5 mM KCl、1 mM MgCl₂、2 mM CaCl₂、および1%ヒト血清アルブミン)に10⁵細胞/50 μL以下で再懸濁し、準備ができるまで細胞を4°C(1〜2時間)に保ちます。実験で使用します。
6. すべての生物学的廃棄物は、関連する機関のガイドラインに従って処分してください。
7. コントロール細胞集団として必要な場合は、臍帯血PBMCから活性化CD8⁺ T細胞を調製し、抗CD3抗体と抗CD28抗体の混合物で覆われたT25培養フラスコの5mLに完全培地に10 7個の細胞をそれぞれ10 μg/mLおよび1 μg/mLで入れます。
8. 翌日、活性化した臍帯血細胞をフラスコから取り出し、新鮮な完全培地で1回洗浄し、組換えIL-2(100 U/mL)の存在下で2週間細胞を増殖させます。
9. 臍帯血CD8⁺ T細胞を、製造元の指示に従って市販のキットを使用して陰性免疫磁気選別により精製します。LNおよびPB CD8⁺ T細胞については、ステップ1.3–1.6で説明したように、細胞をカウントし、培地をアッセイバッファーに交換します。

2. 平面脂質二重膜の調製のための成分

1. (a)0.4 mM DOPC(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)リポソーム、(b)33 mol%のDOGS-NTA(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[(N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジアセティック酸)サクシニル](アンモニウム塩))脂質を含む0.4 mM DOPCリポソーム、(c)4 mol%のビオチニル-キャップ-PE(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(キャップビオチン)(ナトリウム塩)を含む0.4 mM DOPCリポソームを調製します。
2. 前述のように5%カゼイン溶液を調製します。
   1. カゼイン粉末5gを超純水100mLに溶解し、10M水酸化ナトリウム350μLを加えます。通常のマグネチックスターラーで、利用可能なスケールに応じて低速で、室温で2時間、その後4°Cで一晩攪拌します。pHを7.3に調整し、溶液を100,000 x g、4°Cで2時間超遠心分離します。0.22μmの滅菌フィルターで上清をろ過し、溶液を-80°C.
      でアリコートに保存します 注意：水酸化ナトリウム溶液は化学火傷を引き起こす可能性があり、目に触れると永久的な失明を引き起こす可能性があります。この化学物質またはその溶液を取り扱うときは、ゴム手袋、安全服、および目の保護具を使用してください。
3. 抗CD3抗体をビオチンで標識し、前述のアプローチでモノビオチン化抗体分子を作製します。
   1. ビオチン-PEO4-NHSをジメチルスルホキシド(DMSO)に0.1 mg/mLで溶液を調製します。100 mM重炭酸ナトリウムを含む0.5 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の抗体1 mgに、ビオチン-PEO4-NHS溶液3.7 μLを添加します。
   2. 混合物を室温で2時間インキュベートします。Alexa Fluor 488 NHSエステルの溶液を10 mg/mLのDMSO溶液で調製します。Alexa Fluor 488 NHSエステル溶液をBiotin-PEO4-NHSで標識した抗体に10倍モル過剰で添加します。
   3. 混合物を室温で1時間インキュベートし、通常のマグネチックスターラーでゆっくりと攪拌します。サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、結合していない色素を分離します。
   4. 抗体溶液の光学濃度を280 nm(A280)で測定することにより、抗体濃度を測定します。標識抗体の光学密度を577 nm(A577)で測定します。
   5. 次の式を使用して、色素と抗体の比率を決定します:
      
      手記： 詳細については、製造元のプロトコルをご覧ください。
4. 前述したように、Drosophila発現系で組換え可溶性細胞間接着分子1(ICAM-1)タンパク質を発現します。
   1. ICAM-1のエクトドメインをショウジョウバエ発現ベクターpMT/V5-HisにcDNAコードでクローニングし、誘導性メタロチオネインプロモーターを使用して、C末端にHis6タグを付加した組換えタンパク質を作製します。
   2. 得られたICAM-1含有プラスミドおよび遺伝性(G418)発現ベクターとS2細胞を共トランスフェクションします。シュナイダーのショウジョウバエ培地に10%ウシ胎児血清(FCS)と0.5 mg/mLのG418を3週間添加し、安定トランスフェクタントを選択します。無血清昆虫培地で細胞を増殖させ、0.5 mM CuSO₄で3日間タンパク質発現を誘導します。
   3. 培養上清を10倍濃縮し、前述のようにタンジェンシャルフロー濃縮器を介してPBSに対して透析します。
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   4. ファロースを共有結合固定化抗ICAM-1モノクローナル抗体を含むカラムに濃縮培養上清を適用し、結合したICAM-1を50 mMグリシン緩衝液(pH 3.0)で溶出します。溶出したICAM-1タンパク質を2 M Trisバッファー(pH 8.0)で直ちに中和します。
   5. 溶出した材料をPBS、pH 8.0に対して透析し、Ni-NTA(ニッケル-ニトリロ酢酸)アガロースを含むカラムに透析材料を添加します。溶出性ICAM-1と200 mMイミダゾール、pH 8.0。溶出した材料をPBSバッファー(pH 8.0)に対して透析します。
   6. 精製したICAM-1をCyanine5 N-ヒドロキシスクシンイミド(Cy5 NHS)エステルで標識します。
      手記：最終的な色素とタンパク質の最適な比率は1:1です。
5. パパイン消化により抗CD107a抗体からFabフラグメントを作製し、前述のようにイオン交換クロマトグラフィーによりFabフラグメントを精製します。製造元の指示に従って、Alexa Fluor 568 NHSエステルでFabフラグメントを標識します。

3. ガラス担持平面脂質二重膜の形成

1. 140 mLの濃硫酸と60 mLの30%過酸化水素を混合して、新鮮な酸性ピラニア溶液を準備します。フロースライドのガラスカバースリップを酸性ピラニア溶液に30分間浸して洗浄します。ポリプロピレン製のハサミ型鉗子でガラスカバースリップを挟む
   注意： ピラニア溶液は非常に強力な酸化剤です。ソリューションを取り扱うときは、常に安全メガネやゴーグル、またはフルフェイスシールドと厚手のゴム手袋を着用することを忘れないでください。ヒュームフードの下のピラニア溶液でのみ作業してください。使用中は、爆発する恐れがありますので、加熱、輸送、振ることは避けてください。ピラニアの廃棄物を鉛入りの穴の開いたガラス瓶に集めます。廃棄物の適正利用については、施設安全委員会にお問い合わせください。
2. 洗浄したカバースリップを超純水で7回すすぎ、真水の入ったビーカーに順番に移します。濡れたカバースリップを脇に置いて、残りの水がきれいなガラスから転がり落ちるのを待ち、乾いたガラスを残します。
   1. または、真空ポンプに取り付けられたピペットチップを使用して、カバースリップに残っている水滴を慎重に取り除きます。
3. 滅菌フード内で、さまざまな脂質の希釈を行い、二重層を作るためのリポソームミックスを生成します。まず、37 μLのDOPCリポソームと3 μLのビオチニル-Cap-PEリポソームを組み合わせます。次に、14 μLのDOPCリポソームと15 μLのDOGS-NTAリポソームを混合します。第三に、第1の混合物の1μLを第2の混合物の29μLに加えて、最終的なリポソーム混合物を製造します。
4. 滅菌フード内には、乾いたカバースリップを近くに置いたワークスペースを設置します。最終リポソーム混合物(ステップ3.3を参照)の2 μLを、自己接着性スライドチャネルの中央に正確に分注します。清潔で乾燥したカバースリップをスライドにすぐに非常に正確に位置合わせし、スライドの粘着性のある側でカバースリップを静かに下げます。
   1. 複数のスライドを準備する場合は、リポソーム混合物が急速に蒸発するため、一度に1枚のスライドで作業します。スライドを裏返し、ポリプロピレンはさみ型鉗子の外輪を使用して、カバースリップとスライドの周辺接触に穏やかな圧力をかけ、スリップがスライドにしっかりと取り付けられていることを確認して漏れを防ぎます。
      手記： カバースリップの破損やひび割れを防ぐために、スライドのチャネルを押し付けないでください。
   2. スライドを再度裏返し、アセンブリの外部スライド側の二重層の周りに油性マーカーで4つのドットを描画することにより、カバーガラスとチャネルスライドの間の滴のように見える形成された二重層の位置をマークします。
5. チャネルに液体を最初に注入する前に、チャネルの一方のポートを入口ポートとして指定し、もう一方のポートを出口ポートとして指定し、実験全体を通じてこの指定を維持します。
6. 気泡の形成を防ぐため、ピペットチップの端をチャネルの入口ポートに直接挿入します。スライドのチャネルを50 μLの温かい(少なくとも室温の)アッセイバッファーでゆっくりと満たします(バッファー組成についてはステップ1.5を参照)。
7. 0.5 M塩化ニッケル(II)溶液を調製します。2 mLのカゼイン溶液を37°Cのウォーターバスで30分間解凍し、最終濃度200 μMの塩化ニッケル溶液で補います。
8. 最初にチャネルの入口ポートに100 μLのカゼイン溶液を注入し、次にすぐにピペッティングでスライドの出口ポートから100 μLを除去して、二重層を洗浄します。100 μLのカゼイン溶液を各チャネルのエントリーポートに注入し、スライドを室温で45分間インキュベートすることにより、同じ溶液で二重層をブロックします。
9. Cy5-ICAM-1-His₆およびストレプトアビジンタンパク質のアリコートを解凍します。アッセイバッファー中のタンパク質を、それぞれ最終濃度2 μg/mLで組み合わせます。溶液を20,000 x g、4°Cで30分間遠心分離し、凝集体を除去します。
10. ピペッティングにより、残りのブロッキング溶液をスライドチャネルの出口ポートから取り出します。ICAM-1とストレプトアビジンを含む溶液100μLをエントリーポートに注入します。
11. スライドを室温で45分間インキュベートします。出口ポートから余分なタンパク質溶液を取り除きます。最初に100 μLのアッセイバッファーをチャネルの入口ポートに注入し、次にすぐに100 μLを出口ポートから取り出して、二重層を2回洗浄します。
12. Alexa-Fluor-488標識抗CD3抗体をアッセイバッファーで希釈し、最終濃度2 μg/mLにします。抗体溶液100 μLをスライドのエントリーポートに注入し、室温で45分間インキュベートします。出口ポートから余分なタンパク質溶液を取り除きます。ステップ3.11と同様に、100 μLのアッセイバッファーで二重層を2回洗浄します。

>4. T細胞と平面二重膜との相互作用のイメージング

1. ステージと共焦点顕微鏡または全反射蛍光(TIRF)顕微鏡の対物レンズを予熱し、温度が37°Cで平衡化するまで、加熱されたステージ上に二重膜を取り付けてスライドをセットアップします。インクマークに従ってステージを適切な位置に移動し、Cy標識ICAM-1分子の蛍光を利用した二重膜にピントを合わせます。
   1. 共焦点顕微鏡には61倍対物レンズを、TIRF顕微鏡には100倍対物レンズを使用し、適切なフィルター設定を行います。
2. TIRF顕微鏡による顆粒放出イメージングでは、Alexa-Fluor-568標識抗CD107a抗体Fabフラグメントを最終濃度4 μg/mLで細胞懸濁液に添加してから、細胞をエントリーポートに注入します。
   1. LN PBまたは臍帯血から単離した調製したCD4⁺ T細胞を再懸濁し、細胞懸濁液50μLを二重層を含むスライドチャネルの入口ポートに注入します。
3. 必要なフィールド数を選択し、各フィールドの画像を 2 分ごとに 1 回、注入後 30 分間記録します。
4. 共焦点顕微鏡の明視野、反射光、蛍光チャンネル(Alexa 488およびCy5)を利用して画像を取得します。Alexa-Fluor-488およびAlexa-Fluor-568蛍光にはTIRFモードを使用し、Cy5蛍光には広視野モードを使用し、TIRF顕微鏡では明視野イメージングを行います。