方法論記事

樹状細胞とCD4+ T細胞との相互作用に対する免疫調節薬理剤の効果

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Wei, H., et al. マウスの寛容性樹状細胞の開発と機能特性評価。J. Vis. Exp.(135)、(2018)。

このビデオでは、免疫調節薬理剤を使用して樹状細胞(DC)を寛容性DC(TolDC)に変換する方法を示します。この変換は、CD4+ T細胞に対する免疫抑制効果を通じてTolDC機能を評価することによって確認されます。

プロトコル

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1. TolDCのin vitroおよびin vivoの機能評価

  1. T細胞同系増殖アッセイ
    1. オートクレーブですべての手術器具を滅菌し、適切な安全手順を施したクラスIIの生物学的安全キャビネットで実験を行います。
    2. 0.5% ウシ血清アルブミン(BSA)と 2 mM EDTA を 500 mL PBS に溶かして MACS バッファーを調製します。0.2 μmフィルターでろ過してバッファーを滅菌します。
      手記：次の実験中は、バッファーを氷の上に置いておきます。
    3. CD4+ T細胞を得るためには、CO2チャンバーを用いてOT−II T細胞受容体(TCR)トランスジェニックマウスを8〜10週齢で安楽死させる。マウスを解剖ボードに置き、70%エタノールですすいでください。手術用ハサミと鉗子を使用して、腹部の左側から脾臓を分離します。
    4. 2 mLのPBSを入れた脾臓を6 cmの培養皿に入れ、3 mLシリンジのプッシュスティックの裏側を使用して、40 μmの細胞ストレーナーを通して脾臓をミンチにします。
    5. 細胞懸濁液を回収し、300 x gで5分間遠心分離します。
    6. 細胞ペレットを400 μlのMACSバッファーに再懸濁します。
    7. CD4+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail 100 μlを4°Cで5分間加えます
      手記： 抗体カクテルは、CD8a、CD11b、CD11c、CD19、CD25、CD45R(B220)、CD49b(DX5)、CD105、Anti-MHC class II、Ter-119、TCRγ/δなど、CD4+ T細胞以外の他の細胞タイプに結合します。
    8. MACSバッファー300μlと抗ビオチンビーズ200μl(材料表)を4°Cで10分間加えます。
    9. 強磁性球(材料表)とPre-Separation Filterを一緒に磁場に置き、3 mLのMACSバッファーですすいでください。
    10. 細胞内に9 mLのMACSバッファーを加え、300 x gで5分間遠心分離します。
    11. 細胞ペレットを3 mLのMACSバッファーに再懸濁し、カラムに塗布します。CD4+ T細胞を含むフロースルーを回収します。
    12. カラムを別の3 mLのMACSバッファーで洗浄し、フロースルーも回収します。
    13. 脾臓パンDCを取得するには、CO2チャンバーを使用してC57BL / 6マウスを8〜10週齢で安楽死させます。マウスを解剖ボードに置き、70%エタノールですすいでください。手術用ハサミと鉗子を使用して、腹部の左側から脾臓を分離します。コラゲナーゼD溶液2ml(カルシウムとマグネシウムを含むHBSSに溶解したコラゲナーゼD2mg/mL)を入れた6cmの培養皿に脾臓を入れます。
    14. 1 mLのコラゲナーゼD溶液を1 mLの注射器と25 Gの針で脾臓に2回注入します。小さなハサミで脾臓を細かく切ります。
    15. 振とうし、室温で25分間インキュベートします。
    16. 0.5 M EDTA500 μlを室温で5分間添加します
      手記： 1.1.13 から 1.1.14 の手順は、DC の歩留まりを増やすために重要です。
    17. 次に、3 mLシリンジのプッシュスティックの背面を使用して、40 μmの細胞ストレーナーを通過させて脾臓スラリーをミンチにし、300 x gで5分間遠心分離して細胞懸濁液を回収します。
    18. 細胞ペレットをMACSバッファー350 μl、FcR Blocking Reagent50 μl、Pan Dendritic Cell Biotin-Antibody Cocktail100 μlに4°Cで10分間再懸濁します< br /> 手記：DCによって発現されない抗原に対する抗体カクテル。
    19. 9 mLのMACSバッファーを加えて細胞を洗浄し、300 x gで5分間遠心分離します。
    20. 細胞ペレットを800 μlのMACSバッファーに再懸濁し、200 μLの抗ビオチンビーズを4°Cで10分間加えます。
    21. 1.1.9 から 1.1.11 の手順を繰り返して、DC を収集します。
    22. カラムをさらに3 mLのMACSバッファーで2回洗浄し、フロースルーも回収します。
    23. 100-400 nM CDDO-DFPAの存在下または非存在下で2 x 105 DCs/mLを37°Cで1時間1時間処理します。別途、CD4+ T細胞(1 x 107/ml)を1 μM CFSEで37°Cで15分間標識し、PBSで洗浄し、容量を再調整して2 x 106 T細胞/mLの最終濃度を得ます。
    24. 次に、96ウェルプレートで、処理した樹状細胞100 μlを、上記ステップで採取した同量のCFSE標識CD4+ T細胞と共培養し、1:10の比率を得ます。次に、ウェルあたり100 ng / mLのオボアルブミン(OVA)ペプチド323-329を添加し、インキュベーションの2〜3日後にフローサイトメトリーでT細胞のCFSE強度を測定します><。 手記：DC細胞とT細胞のセル数と比率は、これまでの研究から最適化されています。

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CDDO-DFPA(RTA-408)リアタ・ファーマシューティカルズインハウスシンセシス細胞培養
マウスGM-CSFペプロテック株式会社315から03BMDCの差別化
汎樹状細胞単離キットミルテニーバイオテック株式会社130-100-875T細胞増殖アッセイ
パン樹状細胞ビオチン抗体カクテルミルテニーバイオテック株式会社130-100-875T細胞増殖アッセイ
CD4+ T細胞単離キットミルテニーバイオテック株式会社130-104-454T細胞増殖アッセイ
CFSEのバイオレジェンド423801T細胞増殖アッセイ
FcRブロッキング試薬ミルテニーバイオテック株式会社130-100-875T細胞増殖アッセイ
抗ビオチンマイクロビーズミルテニーバイオテック株式会社130-104-454T細胞増殖アッセイ
1mlシリンジBDバイオサイエンス309626T細胞増殖アッセイ
BSAのシグマ・アルドリッチA2058(英語版)T細胞増殖アッセイ
EDTAのサーモフィッシャーサイエンティフィック15575020T細胞増殖アッセイ
LSカラムミルテニーバイオテック株式会社〒130-042-401T細胞増殖アッセイ
プレセパレーションフィルターミルテニーバイオテック株式会社〒130-095-823T細胞増殖アッセイ
コラゲナーゼDシグマ・アルドリッチ株式会社11088858001T細胞増殖アッセイ
HBSSのサーモフィッシャーサイエンティフィック14025076T細胞増殖アッセイ
オボアルブミン(OVA)ペプチド323–329シグマ・アルドリッチ株式会社O1641T細胞増殖アッセイ

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MHC IICFSET

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