肥満細胞の分泌顆粒のエキソサイトーシスを可視化するIn Vitro技術

要約

出典:Klein, O., et al.Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis J. Vis. Exp. (2018年)。

このビデオは、肥満細胞のエキソサイトーシスを視覚化する手法を示しています。細胞は、蛍光レポーターであるFITC-デキストランとインキュベートされ、分泌顆粒(SG)内の細胞に取り込まれ、酸性のpHによって蛍光が消光されます。顆粒のエキソサイトーシスを刺激すると、培地の高pHにより、融合したSGs内にレポーター蛍光が誘導され、蛍光顕微鏡で可視化されます。

プロトコル

1. 事前準備

1. RBL(RBL-2H3肥満細胞株)培地の調製
   1. 500 mLの低グルコースダルベッコ修飾イーグルス培地(DMEM)と56 mLのウシ胎児血清(FBS)、5.5 mLのペニシリン-ストレプトマイシン-ナイスタチン溶液、5.5 mLのL-グルタミン200 mM溶液を混合します。.これにより、10% FBS、100 μg/mL ストレプトマイシン、100 単位/mL ペニシリン、12 単位/mL ナイスタチン、および 2 mM L-グルタミンを補給した低グルコース DMEM が得られます。
   2. 孔径0.22μmのトップバキュームフィルターを使用して培地をろ過し、4°Cで保存します。
2. RBL細胞の維持。
   1. RBL細胞を10 cmのディッシュで最大90%のコンフルエントまで増殖させます。細胞培養が健康であれば、細胞は紡錘形をしており、時折突起があるはずです。
   2. 細胞分裂のために、培地を吸引し、それを2mLのトリプシン/ EDTA溶液B.で置き換えることにより、細胞を皿から分離します。
   3. 細胞が剥離したら、ピペットを使用して2mLの培養培地を加えてトリプシンを中和し、細胞を1:2〜1:10の比率で分割します。
3. 20x Tyrodeのバッファーの調製
   1. 54 mM KCl、20 mM MgCl₂、2.74 M NaCl、および8 mM NaH₂PO₄のストック20倍溶液を二重蒸留水(DDW)で調製します。よく混ぜて4°Cで保存します。

2. 生細胞顕微鏡法のためのRBL細胞の培養

1. FITC-デキストラン溶液の調製。
   1. 培地1 mLあたり1 mgのフルオレセインイソチオシアネート(FITC)-デキストラン粉末(150 K)を混合します(ステップ1.1.1を参照)。フルチャンバーのカバーグラスの場合は、3mLを準備します。
   2. 孔径0.22μmの酢酸セルロースシリンジフィルターユニットを使用して、溶解したFITC-デキストランをろ過します。
   3. マウス免疫グロブリンE(IgE)を1 μg/mLの濃度で添加します。
2. イメージングのためのRBL細胞の播種
   1. イメージングの前日に、培養皿から培地を吸引し、2 mLのトリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液B.と交換します。37°Cで5%CO₂の加湿雰囲気で5〜10分間インキュベートします。細胞が分離したら、2 mLの培養培地を加えてトリプシンを中和します。
   2. 血球計算盤を使用してRBL細胞をカウントし、培養培地でそれに応じて容量を調整して、7.5 x 10⁵ / mLの細胞濃度を取得します。
   3. 新鮮なFITCデキストラン添加培地をあらかじめ充填したチャンバーカバーグラスに、細胞懸濁液10 μLを加えます(これにより、チャンバー内に7.5 x 10³細胞が播種されます)。
   4. RBL細胞を5%_CO2の加湿雰囲気、37°Cで一晩増殖させます。細胞が分離されていること、および顕微鏡下で各細胞を個別に識別することが容易であることを確認するために、細胞はサブコンフルエントレベルにとどまる必要があります。
3. RBL細胞のトランスフェクション - オプション。
   1. 他の蛍光標識タンパク質と組み合わせたエキソサイトーシスイベントのイメージングについては、Azouz et al. の RBL 細胞のトランスフェクションプロトコルを参照してください。

3. エキソサイトーシスの生細胞顕微鏡検査

1. ソリューションの準備:
   1. ストック溶液を重水素減少水で1:20希釈し、20 mM Hepes pH 7、1.8 mM CaCl₂、1 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、および5.6 mMグルコースで補うことにより、最終的なTyrode緩衝液を調製します。
   2. Tyrodeの緩衝液[ヒト血清アルブミンに結合したジニトロフェニル1 μg/mL(DNP-HAS(Ag))を50 ng/mL 1x濃度]に20倍分泌促進物質試薬を新たに調製します。
   3. 400 mMの塩化アンモニウム溶液を調製し、粉末をTyrodeの緩衝液に溶解します。
2. 細胞の準備。
   1. チャンバーから培地を吸引し、37°Cに予温した300μLのTyrodeの緩衝液を補充して、チャンバー状のカバーガラスを3回洗浄します。最後に、37°Cに予熱した300μLのTyrode緩衝液をチャンバーに補充します。
   2. チャンバー付きカバーガラスを顕微鏡のインキュベーターチャンバーに入れます。チャンバーが安定
   していることを確認してください。
3. 顕微鏡のセットアップ
   1. 追跡する関心領域を選択するには、蛍光光源(従来は水銀ランプ)をオンにし、適切な蛍光フィルターを選択します(FITC-デキストランを表示するための緑色蛍光色素のフィルターを選択します)。関心領域にピントが合い、視野の中央に来たら、光退色や毒性を避けるために光源をオフにしてください。
      注:細胞に組み込まれたFITC-デキストランの一部は蛍光を保持する場合があります。これは、FITC-デキストランがエンドソームなどの非リソソームコンパートメントにも選別される可能性があるためです。
   2. FITC励起に適した照明をONにします。レーザーベースの顕微鏡を使用している場合は、488nmレーザーをオンにします。発光は500〜550 nm付近に集める必要があります(FITC発光ピークは510〜520 nm)。
   3. 共焦点顕微鏡を使用する場合は、ピンホールを最大限開いてください。これにより、低出力のレーザーを使用して漂白や毒性を回避し、細胞のすべての平面からエキソサイトーシスイベントを確実に捕捉できます。
   4. 画像取得の時間間隔をキャリブレーションします。
      1. 細胞が異なれば、調節されたエキソサイトーシスの動態が異なる場合があります。化合物エキソサイトーシスの特異的イメージングには、少なくとも5秒の時間間隔をお勧めします。ただし、一般的な例では、高速イメージングを可能にするには、1 つのフレームの取り込み時間が速いことを確認してください。
      2. レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用する場合は、スキャン方向を双方向に設定し、平均化を許可せず、解像度を512 x 512に設定します(推奨;後者の2つの規定は、漂白と毒性を最小限に抑えるのにも役立ちます)。
4. エキソサイトーシスのイメージング。
   1. 細胞または分泌促進物質の種類に応じて、所望の期間の細胞を画像化します。IgE/AgでトリガーされるRBL細胞では、ほとんどのエキソサイトーシスイベントは活性化から15〜20分以内に発生します。
   2. 細胞を活性化するには、20x分泌促進物質溶液から16 μLをチャンバーに加えます。
5. 細胞内のFITC-デキストランの存在を確認します。
   1. FITC-デキストランの存在とSGへの局在を確認するには、16 μLの塩化アンモニウム溶液(焦点を失わないようにチャンバーを動かさないように注意してください)をチャンバーに穏やかに加えます(これにより、最終濃度が20 mMになります)。これにより、SGのアルカリ化とFITC蛍光の消光が誘発され、数秒以内に発生します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM低グルコース	生物学的インダクトリ	01-050-1A
ウシ胎児血清	ギブコ	12657
ペン-連鎖球菌-ナイスタチン溶液	生物学的インダクトリ	03-032-1B
L-グルタミン 200 mM 溶液	生物学的インダクトリ	03-020-1A
FITCデキストラン150K	シグマ・アルドリッチ	46946-500MG-F
トリプシン/EDTA溶液B	生物学的インダクトリ	03-052-1A(ゼロ	使用前に37°Cのウォーターバスで温めてください
孔径0.22μmのトップバキュームフィルター	シグマ・アルドリッチ	CLS430769-1EA
酢酸セルロースシリンジフィルターユニット、孔径0.22 μm	ザルトリウス	16534K 閲覧数
チャンバーカバーガラス	サーモサイエンティフィック	155411
コーニングの組織培養処理済み培養皿	シグマ・アルドリッチ	CLS430167
ウシ血清アルブミン	シグマ・アルドリッチ	A4503の
抗DNPモノクローナルIgE	シグマ・アルドリッチ	D8406
DNP-HSA(アグリ)	シグマ・アルドリッチ	A6661 (英語	直射日光を避けてください
Hepes緩衝液1M、pH 7.4	生物学的インダクトリ	03-025-1B
CaCl2	メルク	102382
グルコース	BDHラボラトリーズ	284515V
塩化アンモニウム	メルク	1145
PIPESジカリウム塩	シグマ・アルドリッチ	108321-27-3
酢酸カルシウム水和物	シグマ・アルドリッチ	114460-21-8
酢酸マグネシウム四水和物	シグマ・アルドリッチ	M5661
グルタミン酸カリウム(L-グルタミン酸カリウム塩一水和物)	シグマ・アルドリッチ	G1501
NaH2PO4	メルク	6346
NaCl	メルク	106404
MgCl2	メルク	105833
KClの	メルク	104936
エレクトロポレーター	BTXの	ECM830
共焦点顕微鏡、ツァイス	ツァイス	LSM 5 Pascal、Axiovert 200M	図 3 で使用されています。電子温度制御を装備
エアストリームインキュベーター
共焦点顕微鏡、ツァイス	ツァイス	LSM 800、アクシオオブザーバー.Z1 /7	図 2 で使用されています。GaAsP検出器を搭載し、電子温度制御
エアストリームインキュベーター
共焦点顕微鏡、ライカ	ライカ	SP5	図 1 で使用されています。ライカHyD検出器とトップステージインキュベーター(okolab)を搭載
RBL-2H3細胞			RBL-2H3細胞は、Reuben P. Siraganianの研究室でクローニングされました。参考文献67を参照してください

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