カルシウムフラックスアッセイを用いた抗遺伝子リポソームによるB細胞活性化のモニタリング

要約

出典:Bednar, K. J. et al., Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies.J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオでは、抗原性リポソームの利用によるB細胞の活性化の評価を紹介しています。カルシウム感受性Indo-1色素で処理したB細胞は、フローサイトメトリーを用いて鑑別し、その紫色と青色の蛍光比を分析します。細胞が抗原性リポソームに遭遇すると、カルシウムの流入を通じてB細胞の活性化が引き起こされ、時間の経過とともに紫色と青色の蛍光シグナル比が徐々に向上します。

プロトコル

1. タンパク質抗原とPEG化脂質の結合

1. 250 mLの真空フラスコに、分画範囲が1,500〜30,000ダルトン(Da)の架橋デキストランゲルビーズ3 gを加えます。60 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、マグネチックスターバーで連続的に攪拌します。フラスコを密封し、真空に取り付けて、攪拌板で最低1時間ガス抜きを開始します。
2. ターンオーバーストッパーを閉じた1.0 cm x 30 cmのガラス製クロマトグラフィーカラムで、PBSをカラムに添加して洗浄します。ターンオーバーストッパーを開き、カラムを排水します。洗浄後、脱気したビーズのスラリーをカラムに加えます。カラムがビードの高さ約24cmまで充填されるまで、スラリーを絶えず加えます。
3. カラムのパックされたビーズの上に約4〜5 cmのPBSの「ヘッド」が表示されたら、次の手順を準備します。
   1. カラムの上部から1〜2フィート上の棚に到達するのに十分な長さのチューブを測定し、カラムの下部近くで落下してカラムの上部に戻るループを作成することにより、重力フローサイフォンを作成します。チューブの一方の端にターンオーバーストッパーを追加し、チューブの片側を開いたままにします。オープンチューブの端をPBSの500 mLボトルに入れ、カラムの上の棚に置きます。
   2. ターンオーバーストッパーで端を取り、10mLシリンジを取り付けます。チューブラインのターンオーバーストッパーバルブを開き、チューブを通してPBSを引き出します。PBSがチューブの4分の3に到達したら、すぐにシリンジを取り外し、カラムの上部にターンオーバーストッパーを追加します—液体がカラムに流れているはずです。
      注:カラムの上部に残るPBSの「ヘッド」の量は、1〜3cmである必要があります。カラムを洗浄する最小量は、カラム容量 3
   個分です。
4. 脂質に結合するタンパク質(モル)の量を、その分子量(MW)に基づいて決定します。
   注:ヤギ抗マウス免疫グロブリンのFabフラグメントであるIgM(それ自体がIgG)は、B細胞のポリクローナル刺激のための普遍的な代理抗原としてここで使用されています。したがって、ヤギIgGのFabフラグメントは、約48キロダルトン(kDa)のMWを有し、総量1.3mgで市販されている。したがって、結合されるタンパク質の量は27.1μmolです。
5. 目的のタンパク質の吸光係数を決定します。不明な場合は、分光光度計を使用して280 nmでのタンパク質吸光度を測定し、A₂₈₀の値をステップ1.4.
   で計算したモル数で割ります。 注:280 nmでのヤギIgGのFabの吸光係数は64,600 ^M-1です。
6. 微量のアミン含有バッファーを確実に除去するには、ステップ 1.1 〜 1.3 で作成したカラムでタンパク質を脱塩し、タンパク質画分を 1.5 mL の微量遠心チューブに回収します (1 分あたり ~500 μL)。
   1. カラム上部に接続されているターンオーバーストッパーバルブを閉じ、カラム上部を取り外します。まだ開いていない場合は、カラムの下部にあるターンオーバーストッパーバルブを開き、PBSの「ヘッド」がビーズの上部に当たるまで待ちます。
   2. ガラス製のパスツールピペットを使用して、ビーズの上部に目的のタンパク質をゆっくりと加え、ビーズの上部への乱れを最小限に抑えるように注意します。
   3. タンパク質溶液の「ヘッド」がビーズの上部に到達したら、パスツールピペットでPBS1 mLを静かに加えます。3回繰り返します。PBSを添加して4〜5 cmのヘッドを作成し、手順1.3を繰り返してカラムを洗浄します
      注:アミン含有バッファーが存在しないことが確実な場合は、この手順をスキップできます。
7. A280値を測定してタンパク質を含む画分を決定し、タンパク質の約90%の回収率を示す画分をプールします。
   注:これにより、通常、タンパク質が1.5〜2倍に希釈されます。プーリング後のタンパク質濃度を決定します。このステップで、必要に応じて、遠心分離濃縮器を使用してタンパク質を濃縮します。
8. ヘテロ二官能性架橋剤の2.5モル相当量をタンパク質に加えます。
   1. まず、約5 mgのスクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸エステル(SPDP、MW = 314 g / mol)を微量遠心チューブに秤量します。SPDPを溶解する容量を決定するには、モルタンパク質濃度と250倍をタクマルチプライして、反応で2.5モルの過剰を与える100倍の溶液を生成します。
      注:例えば、タンパク質濃度が50μMの場合、12.5mMのSPDP溶液が必要です。SPDP5 mgの場合、これは1.27 mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に相当します。.
9. 目的のタンパク質にSPDPを1:100の希釈で添加します。反応液を室温(RT)の振動式シェーカーに約1時間置きます。
10. 余分なSPDPを除去し、内因性ジスルフィド結合を保護するために、その後の還元ステップでタンパク質中のステップ1.1〜1.3で作成したカラムをpH 5.5の100 mM酢酸ナトリウム(NaOAc)で平衡化して洗浄するか、このバッファーで使用するためだけに同一のカラムを作成します。
11. SPDPと1時間インキュベートした後、100 mM NaOAcで平衡化したカラム上でタンパク質を脱塩します。このステップは、100 mM NaOAc(pH 5.5)を溶離液として使用する以外は、ステップ1.6と同じ方法で実行します。フラクションを収集し、A₂₈₀を決定し、上部のフラクションをプールします。カラムをPBSで洗浄します。
12. 2.5 MのDTT(MW = 154 g / mol)を二重蒸留水(ddH₂O)に溶液を調製します。タンパク質のプール画分に25 mM DTTを5〜10分間加えます。
13. タンパク質のA₂₈₀を測定し、これを吸光係数で割ります。また、_A343を決定します。タンパク質(A₂₈₀)とリンカー(A₃₄₃)のモル濃度に基づいて結合比を計算します。
    注:ナノドロップ分光光度計を使用している場合は、A340の自動キャリブレーションをオフにしてください。A₃₄₃の測定値は、DTTによってSPDP架橋剤から除去されるピリジン2-チオン基(吸光係数= 7550 ^M-1)の吸光度を表しています。リンカーのモル比:タンパク質比は、一般に、広範囲のタンパク質に対して2.5モル過剰のSDPDで反応を行った場合に達成されます。
14. 上記のようにPBSで洗浄したカラムにプールしたフラクションを泳ぎます。フラクションを収集し、A₂₈₀を決定し、トップフラクションをプールします。フラクションをプールした後、A280によるタンパク質の濃度を決定します。
15. DSPE-PEG(2000)-マレイミド(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000)-マレイミド)を準備します。これは、10:1のモル比でタンパク質に追加されます。DSPE-PEG(2000)-Maleimideの100倍ストックを準備して、目的の濃度を達成します。
    1. 例えば、ステップ1.14後のタンパク質濃度が10 μMの場合、DSPE-PEG(2000)-Maleimideのストックを10 mMで調製します。DSPE-PEG(2000)-マレイミド(MW = 3000 g / mol)を慎重に秤量し、適切な量のDMSOを添加します。穏やかなボルテックスと超音波処理を複数回行うと、完全に溶解する場合があります。
16. ステップ1.14からフラクションの総量を決定し、溶液を小さな(10〜25 mL)丸底フラスコ(RBF)に慎重に移します。適切な量の100倍DSPE-PEG(2000)-マレイミドをタンパク質に添加して、1倍、10倍のモル過剰、最終濃度を達成します。溶液を静かに渦巻いて、DMSOが完全に分散していることを確認します。
17. 密閉されたRBF中の窒素下で一晩反応を実行します。ゴム製のセプタムを使用し、ドラフトに入れます。
    1. 真空に取り付けられたチューブの端にある3mLシリンジに取り付けられた20Gの針でセプタムに穴を開けて雰囲気を取り除き、真空を3〜5秒間オンにします。
    2. 大気を窒素で置き換えます。半分に切った3mLのシリンジに取り付けたバルーンに窒素を入れ、20Gの針を取り付けます。セプタムに穴を開けて、丸底フラスコ内の雰囲気を窒素で満たします。大気の除去と窒素への置換を繰り返し、窒素バルーンを一晩取り付けたままにします。
18. 1.0 cm x 50 cmのガラスクロマトグラフィーカラムで、分画範囲が4,000〜150,000 Daの架橋デキストランゲルビーズカラムを別途調製します(ステップ1.1〜1.3を参照)。
19. 翌日、ステップ1.17で調製した丸底フラスコからタンパク質を取り出し、クロスリンクしたデキストランゲルビーズカラム(ステップ1.18)上を走らせます(ステップ1.6で使用した方法に従います)
    注:カラムにロードする総量は2 mL以下でなければなりません。より大きな反応を使用した場合は、2つに分割して別々のカラムで分析するか、より大きな直径のカラムで分析します。
    1. フラクションを収集し、A₂₈₀を決定し、トップフラクションをプールし、タンパク質の濃度を決定します。脂質の存在は測定値に影響を与えません。
20. 脂質結合タンパク質の最終プール画分を、使用する準備ができるまで4°Cで保存します。

2. リポソームの調製

1. 脂質を秤量します:DSPE-PEG(2000)(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000、MW = 2805.5 g / mol;コレステロール(3b-ヒドロキシ-5-コレステン、5-コレステン-3b-オール)、MW = 386.7 g / mol;およびDSPC(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン)、MW = 790.1 g / mol。クロロホルム中のDSPCの5 mg / mL溶液、コレステロールの4 mg / mL溶液、およびDSPE-PEG(2000)の2 mg / mL溶液を作成します。
2. 表 1.
   に示すように、リポソーム中の脂質のモル比が 57% DSPC、38% コレステロール、および 5% DSPE-PEG(2000) であることを確認します 注:リポソーム上の抗原の量を制御することが重要です。これは一般に0.01〜0.1%の範囲です。表1では、PEG化脂質に結合したヤギ抗マウスIgM Fabフラグメントの0.1%を使用しています。ステップ1.15でタンパク質に添加されたDSPE-PEG(2000)-マレイミドの10倍モル過剰を考慮に入れて、PEG化脂質の総量が5%を超えないようにすることが重要です。
3. 押出成形用の脂質を作成する際には、最終的な脂質量(μmol)を考慮してください。1.25 μMの総脂質濃度でリポソームを生成するためのモル脂質濃度を計算する例については、表1を参照してください。
4. 一緒に添加する各脂質の正しい量を計算したら、すべてを12mLのホウケイ酸ガラス試験管に混ぜ合わせます。
5. クロロホルムを慎重に吹き飛ばします。
   1. ステップ1.17.1で調製したチューブと針付き3mLシリンジを使用して、チューブ内のクロロホルムを窒素で慎重に吹き飛ばします。もう一方の手でチューブを回転させながら、溶液に窒素の流れを静かに吹き込みます。飛沫を最小限に抑えたり、液体がチューブの側面を流れ落ちたりすると、次のステップでこれを溶液に入れるのが難しくなる可能性があるため、注意してください。
6. 各チューブに100 μLのDMSOを加え、この溶液を一晩凍結乾燥します。チューブの上部を静電気防止の実験室用ワイプで覆い、輪ゴムで固定し、-80°Cで凍結します。

3. リポソームの押し出し

1. 脂質結合タンパク質を含むPBS1 mLを、脂質を含む12 mLチューブに加えます。溶液を超音波処理水浴中で約30秒から1分間超音波処理します。各ラウンドの間に5分以上休憩し、3〜4回繰り返します。
2. メーカーの指示に従って押出機を準備します。
   1. フィルターサポートを内部メンブレンサポートに加え、パラフィンフィルムにPBSを数滴(各10μL)置きます。ピンセットを使用して、フィルターサポートの端をつかみ、10μLの滴に浸します。
   2. フィルターをOリングの内側に置きます。これを両側に対して行います。ピンセットを使用して、10 μLの液滴に浸したエッジディップに0.8 μmのフィルターをつかみ、Oリングの外側をPBSでコーティングします。0.8 μmフィルターをOリングにそっと置き、フィルターが内部メンブレンサポートにはみ出さないようにします。
3. 押出機の加熱ブロックをホットプレートに置き、押出機を予熱します。ホットプレートを低温に切り替え、押出機の加熱ブロックが目的の温度に達するまで待ちます。タンパク質凝集の潜在的な問題を回避するため、ブロックを37°Cを超えて加熱しないでください。
4. 超音波処理されたサンプルを押出機に入れられた押出シリンジの1つにロードします。エクストルーダーシリンジをエクストルーダーのもう一方の端に置きます。空のシリンジプランジャーがゼロに設定されていることを確認してください。空のシリンジは、脂質がポリカーボネート0.8μmメンブレンを通して押し出されると満たされます。気泡がメンブレンを前後に通過しないようにしてください。
5. 完全に組み立てられた押出機を加熱ブロックに入れます。脂質を充填したシリンジのプランジャーを空のシリンジにそっと押し込みます。脂質濃度によっては、これを押し通すのが難しくなります。20回繰り返します。
6. 完全に組み立てられた押出機を加熱ブロックから取り外します。充填されたシリンジを押出機からゆっくりと取り出し、取り外すときに漏れる可能性のある脂質を必ず収集してください。リポソームを清潔なバイアルに入れます。ポリカーボネート0.2μmおよび0.1μmメンブレンを使用して、手順3.4〜3.6を繰り返します。
7. 0.7 × 50 cm² 架橋アガロースビーズカラムを、PBSで平衡化した0.7-10メガダルトン(MDa)の分離範囲で作製します。リポソームを追加し、手順1.6のように実行します。リポソームを含む画分は、250〜400nmの範囲で光の透過率が低下します。
8. リポソームは4°Cで保存し、凍結しないでください。

4. 抗体リポソームによるB細胞活性化をモニターするためのカルシウムフラックス

1. 機関の標準操作手順に従って、二酸化炭素(CO₂)またはイソフルランの過剰摂取によりマウスを安楽死させます。子宮頸部脱臼によるマウスの安楽死を確認します。
2. 手術器具とマウスの死体を70%エタノールで滅菌します。長さ10 cm、先端0.8 mmの湾曲した虹彩鉗子を使用して、胸腔を覆う皮膚を胸郭から分離します。長さ10cmのまっすぐな解剖ハサミを使用して、両側切開で遠位切開を行います。
3. 湾曲した虹彩鉗子と解剖ハサミを使用して、腹腔から脾臓を取り出します。脾臓を囲む脂肪組織を切除し、1%の子牛胎児血清(FCS)とペニシリン-ストレプトマイシンを含む培地で満たされた15mLのポリスチレン円錐管RPMI1640に入れます。.
4. 脾臓と培地を、50 mLのコニカルチューブに取り付けた40 μmのセルストレーナーに移します。3mLシリンジプランジャーのゴム端を使用して、脾臓をやさしく粉砕します。40 μmセルストレーナーを培地で洗浄します。40 μmのセルストレーナーに脂肪組織のみが残るまで、このプロセスを繰り返します。細胞の回復率を高めるために、3〜5mLの培地でふるいをすすぎます。
5. 細胞ホモジネートを300 x gで5分間RTで遠心分離します。遠心分離後、上清を捨て、1x RBC溶解バッファー10 mLをペレットに加えます。ピペットを上下に動かし、RTで2〜3分間放置した後、RTで300 x gで5分間遠心分離します。
6. 上清を捨て、赤血球が枯渇した脾臓細胞を10mLの培地に再懸濁します。血球計算盤またはその他の細胞計数装置を使用して、総細胞数を決定します。上記のように遠心分離により細胞をペレット化します.
   注:脾細胞のIndo-1ローディングに必要な理想的な最終濃度は10–20 x 10⁶細胞/mLですが、より低い濃度の細胞を使用することもできます。
7. 脾細胞をカルシウムフラックスローディングバッファー(ロズウェルパークメモリアルインスティテュート、1% FCS、10 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、1 mM塩化マグネシウム(MgCl₂)、1 mMエチレングリコール-ビス(β-アミノエチルエーテル)-N、N、N'、N'-四酢酸(EGTA)、および5%ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI1640培地)に再懸濁します。1 mM DMSOストック溶液から1.5 μM Indo-1を加え、チューブを数回反転させて混合します。光から保護し、細胞を37°Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。
8. 30分間のインキュベーション後、カルシウムフラックスローディングバッファーの5倍の量を加えます。300 x gで7分間、室温で遠心分離します。
9. B細胞のゲーティングでは、0.5 mLのローディングバッファーに1:200 anti-mouse CD5-PEおよびanti mouse 1:200 B220-PE/Cy7を添加し、4°Cで20分間、光から保護
して細胞を染色します。
10. 脾細胞をカルシウムフラックスローディングバッファーで洗浄し、室温で300 x gで7分間遠心分離し、カルシウムフラックスランニングバッファー(1% FCS、1 mM MgCl₂、および1 mM MgCl₂(CaCl 2)を含むハンク平衡塩溶液(HBSS))で細胞を10–20 x 10⁶細胞/mLで再懸濁します。フローサイトメーターで実行する準備ができるまで、光から保護して氷上に保管してください。
11. コンペンセーションのために、未染色および単一染色コントロールを使用してフローサイトメトリーをセットアップします。
    1. 染色した細胞を走らせて、ゲートを適切にセットアップします(図1Aを参照)。Indo-1(紫)対Indo-1(青)プロットを設定し、Indo-1チャネルの電圧を調整して、Indo-1チャネルの電圧を調整して、Indo-1の信号:Indo-1のノイズ比を最大化するために45〜60°の傾きで染色します:B細胞刺激後の比の青の変化.
       注:電圧が高すぎず、セルのかなりの割合(>5%)がプロットの上部に上が
    っていることを確認してください。
    2. プロットの左上部分(紫⁺青^-)をカプセル化する斜めのゲートを作成し、刺激なしでは細胞の<10%がゲート内にあり、刺激後に>75%に増加するのが理想的です。
12. キャップ付きの5 mL丸底ポリスチレンチューブ(蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブ)に0.5 mLの細胞を加え、細胞を37°Cに3〜5分間水浴で温めます。FACSチューブを、再循環ウォーターバスに接続された37°Cのウォータージャケットチャンバーに入れます。
    1. ウォータージャケット内のチューブをフローサイトメーターに流し、データを保存せずに約5,000〜10,000イベント/秒で取得を開始します。細胞が安定したら(15〜30秒)、データ取得を開始し、少なくとも10秒間データを収集してバックグラウンドを確立します。
    2. 鼻水が10のところで、チューブをフローサイトメーターから素早く取り外し、刺激(2〜20μL中の5〜50μM抗原性リポソーム)を加え、ボルテックスをパルスし、FACSチューブをフローサイトメーターに戻します。この時間を通じてデータの取得と保存を維持し、3〜5分間データを収集します。
13. 適切な解析ソフトウェアで、動力学機能の下でデータを解析します。

表1:総脂質濃度1.25μMのリポソームを作成するための計算。ヤギ抗マウスIgM F(ab)フラグメントリポソームの計算表の例です。

名 名 名 台 名 名 銭

MWの	790	387	2900	3000	48000
	DSPCの	コレステロール	ペグDSPE	過剰なPEG-DSPE	aIgM-PEG-DSPE	トータル
モル比	57	38	3.9	1	0.1	100円00銭
質量(mg)	0.56	0.18	0.14	0.04	0.06	0.98
ミリモル	0.71	0.47	0.05	0.01	0.00	1.25
ミリリットル	112.50	45円93銭	70円64銭	0.00	525.97	755円03
			濃度 (mg/mL)
		DSPCの	5
		コレステロール	4
		ペグDSPE	2
		aIgM-PEG-DSPE	0.114

結果

図1:代表的なゲーティング戦略、カルシウムフラックスの結果、および分析。(A)細胞は、生リンパ球(FSC-A対SSC-A)、単一細胞(FSC-W対SSC-W)、およびB細胞(B220 ⁺ CD5^-)のゲーティング戦略を通じて分析されました。(B)B細胞のIndo-1/Ca²⁺フラックス応答(紫色対青色)。対照として、抗IgM Fabフラグメントリポソームと抗IgM F(ab')₂を同じタンパク質濃度(2.5 μg/mL)で投与したカルシウムフラックスと、緩衝刺激細胞のカルシウムフラックスを示しています。10〜22秒が刺激が加えられる時間であるため、この間はデータは取得されないことに注意して...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
モデル2110フラクションコレクター	バイオラッド	7318122
コレストロール	シグマ	C8667	シグマグレード 99%
SPDP	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21857
DSPCの	アヴァンティ	850365
DSPE-ペグ 18:0	アヴァンティ	880120
DSPE-PEGマレイミド	アヴァンティ	880126
押 出 機	アヴァンティ	610000	ホルダー/加熱ブロック付き1mLシリンジ
フィルター 0.1 μm	アヴァンティ	610005
フィルター 0.8 μm	アヴァンティ	610009
10mmフィルターサポート	アヴァンティ	6100014
ガラス丸底フラスコ	シグマ	Z100633
ターンオーバーストッパー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P-301398
チューブ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P-198194
ルーアロック	サーモフィッシャーサイエンティフィック	K4201634503
セファデックスG50ビーズ	GEライフサイエンス	17004201
セファデックスG100ビーズ	GEライフサイエンス	17006001
熱不活化子牛胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10082147
HEPESの(1M)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630080
エグタ	シグマ	E3889
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122
1x RBC溶解バッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	00-4333-57
インド-1	インビトゲン	I1203
CD5-PE	バイオレジェンド	100608
B220-PE-シ7	バイオレジェンド	103222
HBSSの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14170112	カルシウムとマグネシウムなし
MgCl2	シグマ	M8266
CaCl2	シグマ	C4901
Fab抗マウスIgM	ジャクソン免疫研究	〒115-007-020
F(ab')2 抗マウス IgM	ジャクソン免疫研究	〒115-006-020