限外ろ過装置を用いた細菌培養濾液タンパク質濃度

要約

出典: Ryan, J. M., et al. 結核菌 サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮. J. Vis. Exp. (183) (2022)

このビデオは、限外ろ過を使用して、細菌の細胞外小胞を含む細菌培養濾液タンパク質の分離と濃縮を示しています。濃縮された細胞外小胞は、疾患検出の診断マーカーとして機能します。

プロトコル

1. 粗結核菌(Mtb)細胞外小胞(EV)濃縮液の調製

>注:Mtbの培養と培養濾液タンパク質(CFP)の調製に関する詳細な手順については、こちらをご覧ください。細菌培養培地には、オレイン酸アルブミンデキストロースカタラーゼ(OADC)などのEV含有成分またはタンパク質性成分を含む増殖サプリメント、およびTweenなどの界面活性剤を含まないことが推奨されます。また、細菌培養物の品質と採取したCFPをスクリーニングして、細胞死と溶解を限定的に確認することも推奨されます。

1. リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)の全容量を添加して、100 kDaの分子量カットオフ(MWCO)遠心フィルター(材料の表を参照)を準備します。2,800 x g、4°C.
   で5分間遠心分離します。 注:デッドストップ容量のないフィルターを使用する場合、サンプル量がフィルターレベルを下回らないように注意する必要があり、遠心分離中にフィルターが完全に乾燥します。
2. サンプルチャンバーを最大容量までMtb CFPで満たす前に、フロースルーと残りのPBSを廃棄します。2,800 x g、4°Cで遠心分離し、容量が限外ろ過装置の最小容量まで減少するまで遠心分離します。必要に応じて、サンプル全体が十分に減少するまで、ユニットにCFPを追加します。
   手記：必要に応じて、100 kDaのフロースルー(100F)材料の一部をダウンストリームの適格性評価用に保持します。4°Cで保存してください。
3. 濃縮物を含むフィルターユニットに1x PBSを合計デバイス容量まで追加します。1.2 の説明に従ってボリュームを減らします。この手順を5回繰り返して、完全な洗浄とバッファー交換を確実にします。
4. 100 kDaの濃縮CFP保持液(100R)を限外ろ過装置の仕様に従って回収します(材料の表を参照)。100Rが回収されたら、フィルターを最小量の1x PBSで少なくとも3回洗浄し、100Rで洗浄液をプールして回収を最大化します。
5. 100R材料は、製造元の指示に従って、ビシンコニンアッセイ(BCA)で定量します(材料表を参照)。アッセイを行うには、PBSで1:2、1:5、および1:10のサンプルを数回希釈して使用します。サンプルを triplicate.
   でテストします。 手記： 必要に応じて、100R材料の一部をダウンストリームの適格性評価のために保持します。4°Cで保存してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
自動フラクションコレクター	IZONサイエンス	AFC-V1-米ドル
Centricon Plus - 70 遠心フィルター、100 kDaカットオフ	ミリポアシグマ	UFC710008	ステップ1.1で使用した限外ろ過装置
リン酸緩衝生理食塩水、カルシウムとマグネシウムを含まない1X	コーニング	21-040-履歴書
ニトロセルロースメンブレン、ロール、0.2 μm	バイオラッド	1620112