>1. 粗Mtb EV濃縮物の調製
>注:Mtbの培養と培養濾液タンパク質(CFP)の調製に関する詳細な手順については、参考文献を参照してください。細菌培養培地には、オレイン酸アルブミンデキストロースカタラーゼ(OADC)などのEV含有成分またはタンパク質性成分を含む増殖サプリメント、およびTweenなどの界面活性剤を含まないことが推奨されます。また、細菌培養物の品質と採取したCFPをスクリーニングして、細胞死と溶解を限定的に確認することも推奨されます。
- リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)の全容量を添加して、100 kDaの分子量カットオフ(MWCO)遠心フィルター(材料の表を参照)を準備します。2,800 x g、4°C.
で5分間遠心分離します。
手記：デッドストップ容量のないフィルターを使用する場合は、サンプル量がフィルターレベルを下回らないように注意する必要があり、遠心分離中にフィルターが完全に乾燥します。
- サンプルチャンバーを最大容量までMtb CFPで満たす前に、フロースルーと残りのPBSを廃棄します。2,800 x g、4°Cで遠心分離し、容量が限外ろ過装置の最小容量まで減少するまで遠心分離します。必要に応じて、サンプル全体が十分に減少するまで、ユニットにCFPを追加します。
手記：必要に応じて、100 kDaのフロースルー(100F)材料の一部をダウンストリームの適格性評価用に保持します。4°Cで保存してください。
- 濃縮物を含むフィルターユニットに1x PBSを合計デバイス容量まで追加します。1.2 の説明に従ってボリュームを減らします。この手順を5回繰り返して、完全な洗浄とバッファー交換を確実にします。
- 100 kDaの濃縮CFP保持液(100R)を限外ろ過装置の仕様に従って回収します(材料の表を参照)。100Rが回収されたら、フィルターを最小量の1x PBSで少なくとも3回洗浄し、100Rで洗浄液をプールして回収を最大化します。
- 100R材料は、製造元の指示に従って、ビシンコニンアッセイ(BCA)で定量します(材料表を参照)。アッセイを行うには、PBSで1:2、1:5、および1:10のサンプルを数回希釈して使用します。サンプルを triplicate.
でテストします。
手記：必要に応じて、100R材料の一部をダウンストリームの適格性評価のために保持します。4°Cで保存してください。
2. CFPからのMtb EV濃縮のためのサイズ排除クロマトグラフィー
>注:次の手順は、SECカラムと自動フラクションコレクター(AFC、材料の表を参照)を備えた3 mgの100R Mtb CFPを使用する場合に特有のものです。これは、メーカーの仕様に従うことにより、他の開始濃度およびカラムタイプに適合させることができます。さらに、ユーザーは自動フラクションコレクターのユーザーマニュアルを読んで理解することをお勧めします。
- SECカラムを室温まで平衡化します。
- タワーユニットの背面にある電源スイッチを使用してAFCをオンにし、必要に応じてメインメニューのタッチスクリーンのSETUPを押してロードセルの設定を調整します。ロードセルは、最初の使用時、ソフトウェアの更新後、およびフラクション収集量の不一致が見つかった場合にのみ校正する必要があります。
- SETUP画面で、CAROUSEL>CALIBRATEを選択してカルーセルを位置合わせします。13個の小さな穴を上に向けてカルーセルをAFCタワーに挿入し、-ボタンおよび/または+ボタンを押して、流体ノズルがフラッシュ位置の真上に来るようにカルーセルを調整します。
- 平衡化したSECカラムからキャップを取り外します。SECカラムを適切なカラムマウントにスライドさせ、AFCタワーに慎重に取り付けます。カラムの無線周波数識別(RFID)タグがAFCに面していることを確認し、カラムとバルブの間の接続が安全であることを確認します。廃棄物排出口チューブを収集容器に入れます。
- SETUP画面から「Collection Schedule」を選択し、「-」ボタンや「+」ボタンを押して、カウントを13に、サイズを0.5mLに設定します。「Buffer Volume」の設定はデフォルトの2.7 mLのままにしておき、Xを押して「Collection Schedule」ウィンドウを閉じます。
- ホーム画面から [START COLLECTION] を選択し、[YES] を選択して収集パラメーターを確認します。ラベル付きの1.7 mL微量遠心チューブを13本ロードし、蓋を開けてカルーセルの中心を向いています。
- [OK]を選択してAFCを進めてから、カラムリザーバーを取り付け、[OK]を押して再度進めます。YESを押してカラムをフラッシュするオプションを選択し、0.2 μmフィルター付きPBSのカラム容量を1つ追加して、保存バッファーを削除します。フラッシュが完了したら、OKを押してAFCを進めます。
- カルーセルカバーをAFCにかぶせ、[OK]を押します。0.2 μm フィルター付き PBS のカラム容量を 1 個調製します。ピペットを使用して、カラムから余分なバッファーを取り除きます。
- ステップ1.5で定量した3 mgの100Rサンプルを1x PBSで500 μLに含みます。3 mgのサンプルをカラムの上部に加えます。AFCを進め、サンプルがフリットにぶつかるのを待ちます。サンプルがカラムに完全に入ったら、ステップ2.6で調製したPBSをリザーバーに加えます。
- AFCの実行を監視しながら、最初にボイドボリュームを収集し、次に指定されたフラクションを収集します。実行が完了し、カルーセルが廃棄物の位置に戻ったら、カバーを取り外し、カルーセルからフラクションチューブを取り外します。フラクションを4°Cで保存してから、定量(ステップ3)および適格性評価(ステップ4)してください。
- コラムを再利用する場合は、YESを押してコラムをクリーニングするオプションを選択し、それ以外の場合はNOを押します。AFC.
の指示に従ってください。
注:カラムを洗浄し、保存バッファーを通したら、カラムを取り外して蓋をし、4°Cで保存できます。
