出典:Thrikawala, S., et al.宿主と病原体の相互作用の分析のためのゼブラフィッシュ幼生のアスペルギルス胞子の感染。J. Vis. Exp.(2020年)。
このビデオは、ゼブラフィッシュの幼生の真菌感染を定量化する方法を示しています。真菌胞子は幼虫の後脳心室にマイクロインジェクションされ、幼虫は感染の発生を可能にするためにインキュベートされます。感染した幼虫は一定の間隔で収穫され、コロニー形成単位を列挙することで感染の進行が評価されます。
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方法論記事
ゼブラフィッシュ幼生の真菌感染を定量化する技術
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 注射用アスペルギルス属の胞子の調製
- Aspergillus胞子懸濁液から、1 x 106胞子を得るのに必要な体積を計算します。容量は20〜100μLである必要があります。そうでない場合は、0.01%(v / v)滅菌Tween-20(Tween-water;資料の表)。たとえば、計算された容量が5μLの場合、10倍希釈し、希釈した溶液の50μLを使用します
手記：2つのプレート/菌株を調製して、より多くの胞子を収集するか、汚染の場合の予備として準備することができます。 - バイオセーフティキャビネット内の滅菌使い捨てL字型スプレッダーを使用して、1つのグルコース最小培地(GMM)プレート(材料の表)に1 x 106個のアスペルギルス胞子を広げます。プレートの縁に広げないようにしてください。プレートを逆さまにして、37°Cで3〜4日間インキュベートします。
- 収集日には、滅菌ミラクロスと50mLのコニカルチューブ(株ごとに2本)、滅菌Tween-waterの新鮮なボ....
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| デュモン鉗子#5 | ロボズ手術器具株式会社 | RS-5045 | |
| 接眼レンズレチクル | マイクロスコープワールド | リター10 | 針のキャリブレーション用、実体顕微鏡で使用 |
| マイクロインジェクターセットアップ:背圧ユニット | 応用科学機器 | BPUの | |
| フットスイッチ | 応用科学機器 | FTSW | |
| マイクロピペットホルダーキット | 応用科学機器 | エムピップ | |
| 圧力インジェクター | 応用科学機器 | MPPI-3 | |
| マイクロマニピュレーターのセットアップ:マイクロマニピュレーター | ナラシゲ(トライテック) | M-152 | |
| マグネットスタンド&プレート | トライテック | ミンジ-HBMB | |
| ニードルプーラー | サッターインストゥルメント | P-97 | |
| 実体顕微鏡 | ニコン | SMZ-745 | |
| ティッシュライザーII | キアゲン | 85300 | 幼虫を均質化するために |
| 材料 | |||
| アガロース | 漁夫 | BP160-500 | |
| アンピシリンナトリウム塩 | 漁夫 | AAJ6380706 | |
| BSA、分数V | VWRの | AAJ65855-22 | |
| 硫酸カナマイシン | 漁夫 | AAJ1792406 | |
| Lスプレッダー | 漁夫 | 14 665 230 | |
| マイクロキャピラリーニードル(フィラメントなし) | ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI) | TW100-3 | |
| マイクロローダーピペットチップ | VWRの | 89009-310 | アスペルギルス懸濁液を針にロードするには |
| ミラクロス | VWRの | EM475855-1R | アスペルギルス懸濁液をろ過するには |
| N-フェニルチオ尿素 | 漁夫 | AAL0669009 | 色素沈着を防ぐために |
| フェノールレッド、1%溶液 | 漁夫 | 57254 | |
| トリカイン(3-アミノ安息香酸エチル、メタンスルホン酸塩) | 漁夫 | AC118000500 | 幼虫に麻酔をかける |
| Tween-20 (トゥイーン 20 | 漁夫 | BP337-500 | |
| メディア&ソリューション | コンポーネント/レシピ | ||
| E3メディア:60x E3 | 17.2gのNaCl、0.76gのKCl、2.9gのCaCl2、4.9gのMgSO4・7H2O、H2Oで1Lまで | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x ストック、430 ul 0.05 M NaOH、H2O を含む 1 L まで (オプション: + 3 ml 0.01% メチレンブルー) | ||
| トリカインストック溶液 | 2gトリカイン、5gNa2HPO4・7H2O、4.2 ml 60X E3、H2Oで500 mlまで、NaOHでpH 7.0〜7.5 | ||
| グルコース最小培地(GMM)寒天:GMM agar | グルコース(デキストロース)10 g、20x硝酸塩50 ml、TE 1 ml、H2Oで1 L、NaOHでpH 6.5まで、+ 16 g寒天、オートクレーブ | ||
| 20x硝酸塩 | 120 g NaNO3、10.4 g KCl、10.4 g、MgSO4・7H2O、30.4 g、KH2PO4、H2Oで1 L、オートクレーブ | ||
| 微量元素(TE) | 2.20gのZnSO4・7H2O、1.10gのH3BO3、0.50gのMnCl2・4H2O、0.16gのFeSO4・7H2O、0.16gのCoCl2・6H2O、0.16gのCuSO4・5H2O、0.11g(NH4)6Mo7O24・4H2O、 5.00gのNa2EDTAをH2Oで100 mlに、一晩攪拌しながら溶解し、オートクレーブで溶解 |
