ゼブラフィッシュ幼生の真菌感染を定量化する技術

要約

出典:Thrikawala, S., et al.宿主と病原体の相互作用の分析のためのゼブラフィッシュ幼生のアスペルギルス胞子の感染。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオは、ゼブラフィッシュの幼生の真菌感染を定量化する方法を示しています。真菌胞子は幼虫の後脳心室にマイクロインジェクションされ、幼虫は感染の発生を可能にするためにインキュベートされます。感染した幼虫は一定の間隔で収穫され、コロニー形成単位を列挙することで感染の進行が評価されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 注射用アスペルギルス属の胞子の調製

1. Aspergillus胞子懸濁液から、1 x 10⁶胞子を得るのに必要な体積を計算します。容量は20〜100μLである必要があります。そうでない場合は、0.01%(v / v)滅菌Tween-20(Tween-water;資料の表)。たとえば、計算された容量が5μLの場合、10倍希釈し、希釈した溶液の50μLを使用します
   手記：2つのプレート/菌株を調製して、より多くの胞子を収集するか、汚染の場合の予備として準備することができます。
2. バイオセーフティキャビネット内の滅菌使い捨てL字型スプレッダーを使用して、1つのグルコース最小培地(GMM)プレート(材料の表)に1 x 10⁶個のアスペルギルス胞子を広げます。プレートの縁に広げないようにしてください。プレートを逆さまにして、37°Cで3〜4日間インキュベートします。
3. 収集日には、滅菌ミラクロスと50mLのコニカルチューブ(株ごとに2本)、滅菌Tween-waterの新鮮なボトル(株ごとに1本)、および滅菌使い捨てL字型スプレッダーをバイオセーフティキャビネットに持参してください
   手記：ミラクロスは、~8インチ×6インチにカットし、ホイルで包み、オートクレーブ滅菌することができます。
4. ラベル付きの50 mLコニカルチューブにミラクロスを1枚ずつ入れ、キャップを戻します。残りのミラクロスパケットをフードから取り出します。
5. プレートをバイオセーフティキャビネットに持ち込みます。1つのプレートを開き、上部にトゥイーンウォーターを注ぎ、プレートの約4分の3を覆います。
6. 使い捨てのL字型スプレッダーを使用して、もう一方の手でプレートを回転させながら、真菌培養物の表面を前後にゆっくりとこすります。ほとんどすべての胞子がトゥイーン水に均質化されるまでこすり落とします.
   手記：疎水性が高いため、Tween水が加えられたとき、または掻き取り中に胞子が「パフ」を生成する可能性があります。近くのチューブやプレートが汚染されないように細心の注意を払う必要があります。手袋を交換し、異なる菌株の抽出の間に70%エタノールで表面を拭き取ることをお勧めします。
7. 50 mLのコニカルチューブを1本取り、ミラクロスを取り出します。半分に折り、50mLのコニカルチューブの上部に挿入したフィルターにします。
8. プレートからミラクロスの上の真菌ホモジネートをチューブに注ぎます.
   手記：1つのひずみの2つのプレートが準備されている場合は、両方のプレートをこすり落とし、それらを同じ円錐形のチューブに注ぎます。
9. Tween水を注ぎ、コニカルチューブ内の総容量を50mLにします。
10. 900 x gで10分間遠心し、遠心分離機には必ずエアロゾル化防止キャップを使用してください。
11. 上清を~10%の漂白剤溶液に注ぎ、除染します。滅菌済みの1x PBSを50 mLをコニカルチューブに注ぎ、ボルテックスまたは振とうしてペレットを再懸濁します。
12. 900 x gで10分間再度遠心し、上清を注ぎ取り、ペレットを5 mLの滅菌1x PBSに再懸濁します。新鮮なミラクロスを通し、新鮮な50mLのコニカルチューブに入れます。
13. 1.7 mLの遠心分離チューブで真菌ホモジネートを10倍段階希釈(10倍、100倍、1000倍)します(例:10倍溶液の場合、100 μLの真菌ホモジネートと900 μLのTween-waterを混合します)。
14. 胞子がトゥイーンウォーターに排出されるときに胞子が見えない最初の希釈を選択し、この希釈を使用して血球計算盤を使用して胞子の数をカウントします。
15. 調製した真菌ホモジネート(水懸濁液)の胞子濃度を次の式を使用して計算します:
    濃度(胞子/ mL)=中央の25ボックスの胞子の数x希釈係数x10⁴
16. 1.7 mLの微量遠心チューブに、滅菌済みの1x PBSに1.5 x 10⁸胞子/mLの1 mLストックを調製します。この胞子調製物は、4°Cで~4週間保存できます。
17. 注射に使用する前に、1.7 mLの遠心分離チューブで20 μLの胞子調製物と10 μLの1%滅菌フェノールレッドを混合して、最終胞子濃度1 x 10⁸胞子/mLを達成します。注入前に徹底的にボルテックスします.
    注:1%フェノールレッド溶液はフィルター滅菌し、アリコートで保存する必要があります。
18. 模擬注射では、20 μL の 1x PBS と 10 μL の 1% 滅菌フェノールレッドを混合します。

2.注射用寒天プレートの準備

1. E3培地に2%アガロースを調製し、電子レンジで溶かします。
2. 100 mm x 15 mmのシャーレ(プレートあたり~25 mL)に注ぎ、プレートを均一に覆うように渦巻き、冷まします。
3. プレートをパラフィンフィルムで包み、4°Cで逆さにして保存します。
4. 注入する前に、プレートを室温(RT)に戻します。
5. フィルター滅菌した 2% ウシ血清アルブミン (BSA) を ~1 mL をプレートに注ぎ、プレートを傾けて底全体に広げて覆い、E3.
   ですすいでください 注:2% BSA溶液は、フィルター滅菌し、-20°Cで1 mLアリコートとして保存できます。2% BSA前処理により、幼虫がアガロースの表面に付着するのを防ぎます。
6. 緩衝剤入りトリカインを含むE3をプレートに注ぎ、注射するまで放置します。

>3. ゼブラフィッシュ幼虫後脳心室マイクロインジェクション

1. 受精後2日(dpf)に鉗子で幼虫を手動でペトリ皿で解剖します.
   手記：デコレーションは、1.5dpfから注射時までいつでも行うことができます。
2. ペトリ皿からできるだけ多くのE3を取り除き、E3に緩衝した300μg/mLのトリカインを加えて幼虫を麻酔します
   手記：E3中の緩衝液4 mg/mLトリカインの原液を調製し、4°Cで保存することができます。ワーキングソリューションは、4 mLのストック溶液をE3で最大50 mLまで希釈することで作ることができます。
3. 圧力インジェクター、背圧ユニット、フットスイッチ、マイクロピペットホルダー、マイクロマニピュレーター、磁気スタンドとプレートに付属のマイクロインジェクションセットアップを使用し、すべて圧縮空気源に接続してください(材料表)。
4. 圧縮空気バルブを開き、マイクロインジェクターをオンにします。圧力を~25 PSI、パルス持続時間を60 ms、背圧ユニットを1 PSIに設定します。
5. マイクロローダーピペットチップ(材料表)を使用して、約3〜5μLの調製したPBSまたはフェノールレッドの胞子懸濁液をマイクロインジェクションニードルにロードします。針をマイクロマニピュレーターに取り付けます.
   手記：マイクロインジェクション針は、前述のように調製することができる。マイクロインジェクションに使用される実体顕微鏡には、マイクロインジェクション針を校正するための接眼レンズレチクルが必要です。レチクルはステージマイクロメータで校正し、レチクルスケールの長さ(μm)を決定する必要があります。針から排出される胞子懸濁液滴の直径は、液滴と重なる(レチクルの)ハッシュの数に応じて測定されます。
6. マイクロマニピュレーターは、実体顕微鏡で針の端が最低倍率で見えるように配置します。4倍にズームして、針を視界に入れたままにします。
7. 鋭い鉗子を使用して、針の端をクリップします。インジェクションペダルを踏むと、出てくる液滴の大きさをイメージできます。~3 nL の胞子懸濁液が注入されるまで、クリッピングを続けます (ここでは、これは 5 つのハッシュです)。
8. マイクロマニピュレーターと針を邪魔にならないように動かして、幼虫が注入プレートに配置されている間に誤って針に当たらないようにします。
9. E3-トリカインをインジェクションプレートから注ぎ、その後、移送ピペットを使用して、麻酔をかけた幼虫~24匹をできるだけ少ないE3でインジェクションプレートに移します。
10. ゼブラフィッシュの幼生を操作するための小さなツール(ヘアループツールやまつげツールなど)を使用して、幼虫が向いている方向に合わせて幼虫を配置します。具体的には、右を向いたすべてのものを 1 つの列に配置し、すべての左を向いたすべてのものを下に一列に配置します。
    手記：この配置は、プレート上に液体が多すぎると、幼虫が所定の位置から「浮かぶ」ため、困難です。ただし、注射に時間がかかる場合、液体が少なすぎると、幼虫が乾燥したり、麻酔が切れたりする可能性があるため、問題にもなります。したがって、マイクロインジェクションプロセス全体を通じて、プレート上の液体の量に細心の注意を払う必要があります。
11. 顕微鏡のズームを最低倍率に調整します。マイクロマニピュレーターを戻し、針が視野の中央で幼虫に近づくように配置します(30°〜60°の角度)。
12. 最高倍率にズームインし、微調整ノブを使用して針の位置をさらに調整します。幼虫の隣のプレート上の液体に胞子懸濁液を注入することにより、~30〜70個の胞子が針から出ていることを確認します。必要に応じて、射出セットアップの時間と圧力を調整します。
    手記： このテストは、針から出てくる胞子の数が時間の経過とともに増減する可能性があるため、5〜6匹の幼虫ごとに繰り返す必要があります。
13. 幼虫が針の方を向いている列から始めて、針が最初の幼虫の真上にあり、近くに配置されるようにプレートを動かします。
14. マイクロマニピュレーターで針を動かし、耳小胞の周りの組織に針を挿入して後脳室に突き刺します。必要に応じてもう一方の手でプレートを動かし、針の角度で幼虫の正しい向きにします。
15. 針の端が後脳室の中心にあることを視覚的に確認し、フットペダルを押して胞子を注入し、針を静かに引っ込めます
    手記：フェノールレッド染料は、主に後脳心室内にとどまる必要があります。少量は中脳に入るかもしれませんが、前脳や脳の外には到達してはいけません。その場合は、注入する量が大きすぎるため、それに応じて圧力と時間を減らすか、新しい針を校正する必要があります。
16. プレートを下に移動して、その列のすべての幼虫を注入します。次に、プレートを裏返し、すべての幼虫をもう一方の列に注入します.
    手記： 注入に失敗した、または誤って損傷した幼虫は、1)卵黄に数回注入して赤いマークを作成するか、2)針で幼虫を列から引きずり出すことによってマークを付けることができます。
17. 針を上に動かして、再び邪魔にならないようにします。顕微鏡でズームアウトして倍率を下げます。フェノールレッド染料は、各幼虫の後脳にまだ見えるはずです。
18. まず、ヘアループツールで引き離し、ピペットで持ち上げて、注射に失敗した幼虫を処分します。残りの幼虫を新鮮な滅菌E3とトランスファーピペットでプレートから洗い流し、新しいペトリ皿に移します。
19. 必要に応じて、目的の最終実験サンプル数について繰り返します。
20. 幼虫をE3で少なくとも2回すすぎ、麻酔からの回復を確実にします。
21. 追加の処理なしで生存を定量化するには、トランスファーピペットを使用して、幼虫をE3の96ウェルプレート(ウェルあたり1匹の幼虫)に移します。

4. 注入された生存可能な胞子数の設定

1. 注入直後、トランスファーピペットを使用して、注入した幼虫のうち約8匹をランダムに選び、1.7mLの遠心チューブ(チューブごとに1匹の幼虫)に移します。
2. 幼虫をトリカインで安楽死させるか、4°Cで0.5〜2.0時間安楽
死させます。
3. 1 mLの1 mg / mLアンピシリンと0.5 mg / mLカナマイシン抗生物質溶液を滅菌1x PBSで調製します。.残った溶液は4°Cで保存し、後で使用できます.
   手記： アンピシリン(100 mg/mL)およびカナマイシン(50 mg/mL)のストック溶液は、既調製、フィルター滅菌、および-20°Cのアリコートでの保存が可能です。これらを1x PBSで100倍に希釈して、作業溶液を得ます。
4. ピペットを使用して、幼虫を残して遠心チューブからできるだけ多くの液体を取り除き、抗生物質を含む1x PBSの90μLを追加します
   手記：抗生物質は、アスペルギルス属のコロニーのカウントを妨げる可能性のあるGMMプレートでの細菌の増殖を防ぐために使用されます。
5. 組織ライザーで幼虫を1,800振動/分(30Hz)で6分間均質化し、17,000 x gで30秒間スピンダウンします。
6. GMMプレートにラベルを付けます(均質化された幼虫ごとに1つのプレート)。ブンゼンバーナーを使用して無菌環境を作り出し、均質化された懸濁液を1つのチューブからGMMプレートの中央までピペットで移動させ、使い捨てのL字型スプレッダーを使用して広げます。ホモジネートをリムに広げないでください。
7. プレートを逆さまにして37°Cで2〜3日間インキュベートし、形成されたコロニーの数(CFU)をカウントします。
8. 感染期間中に生きている胞子の数を測定するには、注入後1〜7日(dpi)で96ウェルプレートから幼虫を選び、それらを遠心分離チューブに移します。幼虫を安楽死させて均質化し、手順4.1〜4.5で説明されているようにGMMプレートに広げます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
デュモン鉗子#5	ロボズ手術器具株式会社	RS-5045
接眼レンズレチクル	マイクロスコープワールド	リター10	針のキャリブレーション用、実体顕微鏡で使用
マイクロインジェクターセットアップ:背圧ユニット	応用科学機器	BPUの
フットスイッチ	応用科学機器	FTSW
マイクロピペットホルダーキット	応用科学機器	エムピップ
圧力インジェクター	応用科学機器	MPPI-3
マイクロマニピュレーターのセットアップ:マイクロマニピュレーター	ナラシゲ(トライテック)	M-152
マグネットスタンド&プレート	トライテック	ミンジ-HBMB
ニードルプーラー	サッターインストゥルメント	P-97
実体顕微鏡	ニコン	SMZ-745
ティッシュライザーII	キアゲン	85300	幼虫を均質化するために
材料
アガロース	漁夫	BP160-500
アンピシリンナトリウム塩	漁夫	AAJ6380706
BSA、分数V	VWRの	AAJ65855-22
硫酸カナマイシン	漁夫	AAJ1792406
Lスプレッダー	漁夫	14 665 230
マイクロキャピラリーニードル(フィラメントなし)	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(WPI)	TW100-3
マイクロローダーピペットチップ	VWRの	89009-310	アスペルギルス懸濁液を針にロードするには
ミラクロス	VWRの	EM475855-1R	アスペルギルス懸濁液をろ過するには
N-フェニルチオ尿素	漁夫	AAL0669009	色素沈着を防ぐために
フェノールレッド、1%溶液	漁夫	57254
トリカイン(3-アミノ安息香酸エチル、メタンスルホン酸塩)	漁夫	AC118000500	幼虫に麻酔をかける
Tween-20 (トゥイーン 20	漁夫	BP337-500
メディア&ソリューション			コンポーネント/レシピ
E3メディア:60x E3			17.2gのNaCl、0.76gのKCl、2.9gのCaCl2、4.9gのMgSO4・7H2O、H2Oで1Lまで
1x E3			16.7 ml 60x ストック、430 ul 0.05 M NaOH、H2O を含む 1 L まで (オプション: + 3 ml 0.01% メチレンブルー)
トリカインストック溶液			2gトリカイン、5gNa2HPO4・7H2O、4.2 ml 60X E3、H2Oで500 mlまで、NaOHでpH 7.0〜7.5
グルコース最小培地(GMM)寒天:GMM agar			グルコース(デキストロース)10 g、20x硝酸塩50 ml、TE 1 ml、H2Oで1 L、NaOHでpH 6.5まで、+ 16 g寒天、オートクレーブ
20x硝酸塩			120 g NaNO3、10.4 g KCl、10.4 g、MgSO4・7H2O、30.4 g、KH2PO4、H2Oで1 L、オートクレーブ
微量元素(TE)			2.20gのZnSO4・7H2O、1.10gのH3BO3、0.50gのMnCl2・4H2O、0.16gのFeSO4・7H2O、0.16gのCoCl2・6H2O、0.16gのCuSO4・5H2O、0.11g(NH4)6Mo7O24・4H2O、 5.00gのNa2EDTAをH2Oで100 mlに、一晩攪拌しながら溶解し、オートクレーブで溶解

の ) します