昆虫の蛹における炎症性細胞動態の探索のための光変換技術

Abstract

出典:Weavers, H. et al., ショウジョウバエの蛹内の炎症細胞動態の長期In Vivo追跡。J. Vis. Exp. (2018年度)

このビデオは、ショウジョウバエの蛹の炎症性細胞動態を研究するための光変換の使用を示しています。緑色の血液細胞が傷ついた上皮に引き寄せられ、続いて遠くに移動します。光変換は、特定の血球を緑色から赤色にシフトさせ、その動きの追跡を容易にします。

Protocol

このプロトコルは、4つの主要な連続したステップで構成されています:(1)ショウジョウバエストックの調製とショウジョウバエの病期分類、(2)蛹の解剖とマウント、(3)蛹の創傷、(4)in vivoタイムラプス共焦点イメージング。

1. ショウジョウバエのストックの準備と蛹のステージング

1. 適切なショウジョウバエ株を入手してください(「イントロダクション」と「資料の表」を参照)。
2. 適切な遺伝子型の若くて健康な成虫のハエを収集します。
   1. 成虫のハエを選択するには、二酸化炭素ガスパッドを使用してハエに短時間麻酔をかけ、細かいペイントブラシを使用して適切な遺伝子型または性別のハエをコレクションバイアルに移します。
   2. 酵母を添加した標準的なフライフード培地(コーンミール-糖蜜-寒天混合物、材料の表を参照)を含む各バイアルに、20人の処女女性と20人の男性を追加します。
3. 最適な蛹の繁殖のために、成虫は毎日新しい食物の上に飛び、新鮮なバイアルですべてのバイアルを25°Cに保ちます
   手記：Gal4-upstream activating sequence(Gal4-UAS)システムを使用して系統特異的な遺伝子発現を駆動する場合、Gal4-UASシステムは温度に敏感であるため、すべてのステップを25°C以上で実行する必要があります。
4. 予定されたイメージングセッションの18時間前に、バイアルから少なくとも10個の新しく形成された白い蛹(図1A)を選択します(つまり、蛹形成、APFの0時間後)鉗子または細かい絵筆を使用して、内部バイアル表面から蛹を取り除き、蛹を清潔な空のプラスチックバイアルの側面に注意深く移します
   手記：さまよう3^番目の幼虫は、蛹化を受けるために食物培地から上向きに這い上がります。新しく形成された白い蛹は、前気門が一本あり、静止しているため、簡単に識別できます(3^番目の幼虫とは異なります)。キューティクルは「蛹」(蛹の場合)に変化し、最初は柔らかく白いです。蛹の損傷を避けるように注意する必要があります、これは望ましくない損傷誘発性炎症反応だけでなく、重大な発達遅延にもつながる可能性があるためです。
5. 選択した蛹をバイアル内の適切な発達段階(18時間のAPFで最適な結果が得られます)まで25°Cで老化させます
   手記：蛹が発達するにつれて、蛹のケースは徐々に暗くなり、もろくなります。
6. 次のステップのために、他の試薬を事前に準備してください。ヘプタン接着剤を作るには、長さ20cmの丸めた両面テープと20mLのヘプタンを50mLの遠心チューブに組み合わせ、パラフィンフィルムで密封し、ベンチで室温で一晩揺さぶります。

>2. ショウジョウバエの蛹の準備と解剖

1. ステージングされたショウジョウバエの蛹を、スライドガラスに取り付けられた両面粘着テープに移します。腹側がテープにしっかりとくっつき、背側が上を向くように蛹を配置します(図1B).
   手記：蛹の前方は、蛹のケースの前端から突き出た2つの気門から識別できます。
2. 鉗子とマイクロハサミを使用して、明視野解剖顕微鏡で保護蛹のケーシングから蛹を慎重に取り出します(図1B-D)。
   1. 最初に、鉗子を使用して蛹の最も前部を切開します(図1B)。この領域の蛹のケースが中空で、蛹の組織が存在しないことを確認してください。これは、蛹の発育の初期に蛹がケース内で収縮するためです。
   2. この最初の切開後、蛹が茶色の不透明な脆いケーシングから完全に解放されるまで、鉗子またはマイクロハサミ(図1C)を使用して、蛹のケースを前方から後方向に慎重に引き裂くか切り開きます(図1D)
      手記：この段階の蛹は非常に壊れやすく、蛹の表面に穴を開けないように注意する必要があります。穿刺部位から血リンパ液がすぐに漏れ出すため、穿刺は明らかです。穴の開いた蛹は、どんなに小さくても捨てるべきです。
3. ヘプタン接着剤を使用して、蛹をガラス底の皿に取り付けます。
   1. 20 mLのピペットチップを使用して、事前に準備したヘプタン接着剤(上記のセクション1.6を参照)を10 mLの滴をガラス底の皿に一列に置きます。
   2. 接着剤を5秒間乾燥させてから、鉗子を使用して解剖した蛹をヘプタン接着剤に慎重に移します(図1E)。
   3. 傷つけたり、画像化したりしやすいように、蛹を一列に並べます。約5匹の蛹が推奨されますが、経験を積むともっと多くても管理可能になります。
      手記：ヘプタン接着剤の使用は、直立イメージングシステムを使用する場合に推奨されますが、倒立システムを使用する場合には必要ありません。イメージング中に接着剤が光学収差を生じさせる場合は、代わりに蛹をカバーガラスに直接配置することができます - 顕微鏡間でイメージングディッシュを移動する際に注意が払われる限り、ほとんどの場合、蛹組織とガラスとの間の自然な接着は安定したイメージングに十分です。
4. 最良の結果を得るには、翼がカバーガラス上で平らになり、翼面の大部分がカバーガラスに直接接触するように蛹を取り付けます(図1F)。鉗子を使用して蛹を転がし、翼が正しく取り付けられていることを確認するために蛹の位置を変更します。
5. イメージング期間中のサンプルの脱水を防ぐために、マウントの最後にガラス底皿の側面に蒸留水に浸した吸収性フィルターペーパーを追加し、蛹を乱さないように注意してください(図1E)。皿に蓋をします。
   手記：蛹は今、傷つけて画像化する準備ができています。

3. ショウジョウバエの蛹の翅のレーザー誘起創

傷

1. 取り付けられた蛹が入ったガラス底の皿を、チューナブルレーザーアブレーションシステムを備えた広視野顕微鏡に移します。
   1. 435 nmに調整されたパルスUV空冷窒素励起アブレーションレーザーを使用します - 詳細については、材料の表を参照してください。照明に使用される光の正確な波長は、適切な色素セルを介してユーザーによって選択されます。
2. 明視野光学系を使用して、顕微鏡のステージコントロールを調整し、最初に負傷する蛹の蛹の翼を見つけます(図1F)。
3. 最適な結果を得るには、イメージングとレーザーアブレーションの両方にオイル浸漬40Xまたは63X対物レンズを使用します。使用する浸漬液(オイルまたはグリセロール)がアブレーションシステムとイメージングシステム間で一貫していることを確認してください。ファインフォーカスコントロールノブを使用して、ガラスカバースリップに最も近い蛹の翼上皮の平面に焦点を合わせるように顕微鏡を調整します(つまり、負傷する上皮の領域に焦点を合わせます)。
4. 顕微鏡のステージ調整を使用して、傷つける領域がアブレーションレーザーの既知の標的領域と直接位置合わせされるように蛹の翼を配置します。
5. 顕微鏡に取り付けられたエネルギー密度減衰器スライドを使用して、アブレーションライトのパワーレベルを手動で調整します.
   手記：減衰器スライダーには、減衰の相対的なレベルを識別し、再現可能な設定の使用を許可するためのクリックストップとルールがあります。
6. 外部の手動トリガーコントロールを使用して、トリガーを1回短くクリックするだけでアブレーションレーザーを作動させ、傷を作ります。アブレーション部位での一時的な気泡の出現を確認してください 傷は通常それを伴うため。適切な蛍光フィルターを使用して蛹上皮を視覚化し、レーザー誘発創傷が成功したかどうかを確認します。
   手記：レーザー光線に誤ってさらされないように注意してください。ビームの反射は、目や皮膚に深刻な損傷を与える可能性があるためです。
7. 傷害が失敗した場合は、焦点面を変化させ(顕微鏡の焦点を現在の焦点レベルよりわずかに上または下に動かします)、アブレーショントリガーを1回クリックします。あるいは、アッテネータースライドを使用して、目的の創傷サイズが達成されるまでレーザー出力を徐々に増やします。
8. アブレーションレーザーパルスの繰り返し率を変化させるには、背面のコントロールパネルにある繰り返し率ノブを使用します(これにより、レートが1パルス/秒未満から最大60Hzまで変更されます)。最適な巻線を得るには、パルスの繰り返し周波数を40Hzに設定します。
9. さまざまなサイズの傷を生成するには、エネルギー密度減衰器スライドを使用して、アブレーションライトのパワーレベルを手動で調整します。
10. マウントされたすべての蛹を傷つけることを控え、これらの切除されていない蛹を負傷していないコントロールとして使用します。
11. 一貫した結果を得るには、アブレーションシステムを定期的に再調整します(関連する操作マニュアルを使用)。また、レーザー出力波長を制御する色素共振器セルを洗浄し、補充します。

4. In vivo Time-lapse Confocal Imaging

1. ガラス底の皿を適切な顕微鏡にすばやく移し、タイムラプスイメージングを行います。
   手記：最適な結果を得るには、緑色蛍光タンパク質(GFP)とmCherry蛍光色素の両方を検出できる高感度検出器を備えた高仕様の共焦点顕微鏡またはスピニングディスク顕微鏡を使用してください。
2. 蛹の翼全体を画像化するには、低倍率(20倍など)の対物レンズを使用します(図2A)。創傷修復とそれに伴う炎症反応を高い空間分解能で画像化するには、油浸40X(NA 1.3)または63X(NA 1.4)対物レンズを使用します(図2B-Dの代表的な画像を参照)。
3. 顕微鏡に関連付けられている適切な画像キャプチャソフトウェアを開きます。
4. 画像キャプチャソフトウェアを使用して、適切なレーザー、例えば488 nmおよび561 nmレーザーをオンにして、GFPおよびmCherry蛍光色素をそれぞれ視覚化し(関連するボックスをクリックすることにより)、レーザー出力とゲイン/オフセット設定を調整して、ピクセル飽和を回避しながら十分な蛍光シグナルを提供します。光退色および光毒性を最小限に抑えるために、可能な限り低いレーザー出力(5〜20%の範囲)を使用してください。
5. 修復上皮と炎症性細胞の動員の両方を捕捉するには、コントロールパネルの微調整ノブを使用して顕微鏡をzスタックを記録するように設定します。最適な結果を得るには、ソフトウェアを設定します(手動ボタンクリックを使用して)蛹の翼を通してzスライスを記録するように(最小3mmごとに)、負傷した上皮の上部から下の細胞外空間まで(移動する血球を含む)大きなzスタック(50〜100の範囲)を達成するためにmm)。
6. タイムラプスイメージングの場合は、創傷後少なくとも1時間、一定の時間間隔(最小30秒ごと)でzスタックを記録します。
   手記：選択されたzスタック間の正確な時間間隔は、急速に変化する細胞ダイナミクスを捕捉することと、サンプルの光退色を回避することとの間のトレードオフを表しています。
7. 複数の蛹(アブレーションされていない未傷のコントロールを含む)を同時にイメージングするには、電動ステージ(顕微鏡に取り付けられている)とイメージングソフトウェア内のマルチポジション取得機能を使用します。ステージ位置制御ノブを使用してソフトウェア内の各蛹の位置を手動で設定し、次に各蛹の適切なzスタック制限(上部と下部)を手動で設定します。
8. 画像キャプチャ中または後で、z-stack projection または 3D レンダリングを使用して、専門の画像解析ソフトウェア (ImageJ など) を使用して、タイムラプス画像を視覚化します。たとえば、個々の血球の動きを追跡するには(図2C'およびD'のように)、オープンアクセスのImageJプラグイン「TrackMate」または「Manual Tracking」(で公開された方法)を使用して血球核を追跡します。
9. 光変換性プローブ(Kaedeなど)を使用して、イメージング中に上皮細胞または免疫細胞のサブセットを選択的に光変換および標識します。
   1. イメージングソフトウェア内で適切なモジュールを開き、光変換(光退色後の蛍光回復(FRAP)や光退色後の蛍光回復モジュールなど)を実行し、405nmレーザーをアクティブにします(関連するソフトウェアボックスをクリックします)。
   2. FRAPソフトウェア内で、正方形、円形、またはフリーハンドの選択ツールを使用して、写真変換するセルを選択します。FRAPソフトウェア内で、光変換(漂白)の時間経過を1回の反復/フレームに設定し、405nmレーザーを20%のレーザー出力に設定します。手動で [実験を開始] をクリックして、光変換を実行します。
   3. FRAPモジュールを終了し([閉じる]をクリック)、ソフトウェア内の元のイメージング画面に戻ります。488 nmおよび561 nmレーザーを使用して、上記のようにzスタックとタイムラプス記録を設定することにより、光変換されたセルと非光変換されたセルの動作をイメージングします。
      手記：光変換されたプローブは、最初の光変換後何時間も安定しているため、光変換された細胞の挙動を経時的(少なくとも5時間)追跡することができます。例えば、創傷内の炎症細胞は選択的に光変換され(図2F)、損傷部位から分解されるときにそれらの挙動を追跡することができます(図2GおよびH)。

Results

図1:ショウジョウバエの蛹の傷害およびライブイメージングのための準備 (A)0時間のAPFで収集されたショウジョウバエの白い蛹で、前端はエバーテッド呼吸付属器(気門)で示されています。(B)白い0h APF前蛹を25°Cで18時間育てた後、蛹は茶色に見えます。蛹ケースの解剖は、蛹がこの領域から存在しないため、痩せた気門で示される最前方の領域(矢印)から開始し、保護用の蛹ケース(C)を取り外すために細い鉗子および/またはマイクロハサミを使用する必要があります。蛹の翼は、蛹の胸部の外側に見えます(青い輪郭)。(D)蛹のケースは18h APFの蛹から完全に取り外され、ここでは蛹は側面を示すために90°回転され、翼は青で縁取られていま...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ショウジョウバエ株
ユビキタスGFPタグ付きE-カドヘリン;Ubi-p63E-shg.GFPです。(chrII)	京都ストックセンター、DGRC	#109007	Ubi-p63Eプロモーター配列は、C末端にGFPでタグ付けされたショウジョウバエE-カドヘリン(ショットガン)の発現を促進します。
ユビキタスGFPタグ付きE-カドヘリン;;Ubi-p63E-shg.GFP(III)	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(インディアナ大学)	#58742	Ubi-p63Eプロモーター配列は、C末端にGFPでタグ付けされたショウジョウバエE-カドヘリン(ショットガン)の発現を促進します。
ユビキタスGFPタグ付きモエシンP{sGMCA}3.1	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(インディアナ大学)	#59023	遍在的に発現するsqhプロモーター/エンハンサーは、GFPS65Tでタグ付けされたMoesinのフラグメント(アクチン結合配列を含む)の発現を促進します。
血球特異的な蛇-Gal4ドライバー;SRP-ガル4;	カーチャ・ブルックナーによって生成されました	カーチャ・ブルックナーによって生成されました	ポリAテールに融合したScer\GAL4の発現は、ショウジョウバエのヘビの上流からの2つのゲノム配列によって制御されています。参照:Brückner、K.、Kockel、L.、Duchek、P.、Luque、CM、Rørth、P.、Perrimon、N.PDGF/VEGF受容体は、ショウジョウバエの血液細胞の生存を制御します。開発セル。7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-原子力RFP w1118;;P{UAS-レッドスティンガー}6	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(インディアナ大学)	#8545 または #8547	UAS制御配列は、C末端に核局在化シグナルでタグ付けされたDsRed.T4型のRFPの発現を促進します
UAS-細胞質GFP ;;P{UAS-GFP.S65T}	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(インディアナ大学)	複数の在庫が利用可能(例:#1522)	GFPのS65T版のUAS調節配列による発現;S65T変異体は増大した輝度を示す。
UAS-フォトコンバーチブル楓 w1118;;P{UAS-Kaede.A}3	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(インディアナ大学)	#26161	Kaedeタンパク質は、合成後は明るい緑色の蛍光を発しますが、UVを照射すると明るく安定した赤色の蛍光に効率よく変化します。
GFPタグ付きスパゲッティスカッシュw1118;;P {sqh-GFP.RLC}の	ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(インディアナ大学)	#57145	C末端にT:Avic\GFPS65Tタグが付けられたsqhコード領域は、天然のsqhプロモーターの制御下で発現されます。
フライフードメディア用原料			フライフードメディアは、標準的な手順に従って製造されています(Greenspan、R.1997を参照)。フライプッシング:ショウジョウバエ遺伝学の理論と実践。コールドスプリングハーバープレス。
トウモロコシ	Wild Oats、ブリストル、英国(または同等のサプライヤー)	サプライヤーに直接連絡する	有機
大豆粉	Wild Oats、ブリストル、英国(または同等のサプライヤー)	サプライヤーに直接連絡する	有機
麦芽エキス	Wild Oats、ブリストル、英国(または同等のサプライヤー)	サプライヤーに直接連絡する	有機
糖蜜	Wild Oats、ブリストル、英国(または同等のサプライヤー)	サプライヤーに直接連絡する	有機
ディフコ寒天	BDバイオサイエンス、フィッシャーサイエンティフィック	DF0142-15-2	フライフードの調製に
プロピオン酸	シグマ	402907	フライフードの調製に
ニパジェン	シグマ	79721	フライフードの調製に
乾燥パン酵母	レッドスター、ダッチャーサイエンティフィック、英国株式会社	レッドスター、ダッチャーサイエンティフィック、英国株式会社	フライフードの調製に
サンプル調製とマウント
パラフィルム	シグマ	P7793-1EA	ヘプタン接着剤の調製用
細いセーブル絵筆	Daler-Rowney(または同等のもの)	#0 または 1
鉗子	フィッシャーサイエンティフィック(またはファインサイエンスツール)	NC9404145	デュモン #5
イメージング用のガラス底皿	マテック	P35G-0-10-Cの	35mmのシャーレを使用し、少なくとも10mmのマイクロウェル、0.085-0.13mmのカバーガラスをコーティングしないことをお勧めします。より大きなマイクロウェルを備えた皿は、1回の実験でより多くの蛹をマウントし、イメージングすることを可能にします。
ヘプタン	シグマ	51730から5ミリリットル	ヘプタン接着剤の調製用
両面粘着テープ(スコッチなど)	寒天科学	AGG263	ヘプタン接着剤の調製用
50mlチューブ(ヘプタン接着剤用)	Fisher Scientificのファルコンチューブ	14-432-22	ヘプタン接着剤の調製用
ガラス顕微鏡スライド	寒天科学	AGL4244	ショウジョウバエの蛹の解剖に
明視野による実体顕微鏡の解剖	ライカ(または同等品)	M50	ショウジョウバエの蛹の解剖に
マイクロハサミ	ジョン・ワイス・インターナショナル	103123	ミニチュア研究用ハサミ(ストレート)
レーザーアブレーションとイメージング
Nitogenアブレーションレーザー	Spectra-Physics(またはAndor相当)	モデル: VSL-337ND-S	傷害の場合、これを広視野イメージングシステムに取り付ける必要があります
マルチレーザー共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)	ライカ(または同等品)	TCS AOBS SP8 または SP5-II をライカ DMi8 倒立落射蛍光顕微鏡 (または同等品) に取り付けた	理想的には、マルチサイトおよび「モザイク」スキャン用の電動ステージに加えて、「ハイブリッド」GaAsP検出器(はるかに高い感度と低信号のブーストを提供)が含まれます
環境チャンバー	ライフイメージングサービス(または同等のサービス)	「顕微鏡温度制御システム」	イメージング時の温度制御のために共焦点顕微鏡に取り付けます
画像解析ソフトウェア
FRAPソフトウェアモジュール	ライカ(または同等品)	CLSM FRAPソフトウェアモジュール	Kaedeなどの光変換性蛍光色素の光変換に
ImageJ (画像解析ソフトウェア)	国立衛生研究所(NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider、CA、Rasband、WS、Eliceiri、KW「NIHイメージからImageJへ:画像分析の25年」。ネイチャーメソッド 9, 671-675, 2012.
ImageJプラグイン「Manual Tracking」	国立衛生研究所(NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJプラグイン「TrackMate」	ImageJ、NIHの	https://imagej.net/TrackMate	ティネベス、JY。Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity(高性能3Dイメージングソフトウェア)	パーキン・エルマー	ボロシティ 6.3	画像解析用
IMARIS(画像解析ソフトウェア)	ビットプレーン	細胞生物学者のためのIMARIS	画像解析用