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1. 細菌の培養と調製
>注:このプロトコルで使用される細菌種は、カプセル化された毒性株、B.炭疽菌エイムズです。この種を使用したすべての操作には、適切なバイオセーフティとセキュリティクリアランスが必要であり、BSL-3研究所にあるクラスIIまたはクラスIIIの生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。BSL-3の作業および細菌を取り扱う際の個人用保護具の使用については、機関の運用手順に従ってください。
- 37 g BHI粉末を1 Lの水に溶解し、121°Cで15分間オートクレーブすることにより、Brain Heart Infusion(BHI)ブロスを調製します。
- 8%重炭酸ナトリウム溶液を水に調製し、0.20 μmフィルターシリンジを使用して滅菌します。溶液は4°Cで保存し、1日以内に使用してください。
- 8 gの栄養ブロス、3 gの酵母抽出物、および15 gの寒天を1 Lの水に混ぜて、NBY寒天プレートを準備します。オートクレーブを121°Cで15分間保存します。ペトリ皿に注ぎ、固化させます。プレートを4°C.
で保存します
手記：NBY寒天プレートは、重曹の有無にかかわらず作成できます。重曹をブロスプレートおよび寒天プレートに添加すると、カプセル化された桿菌からなるムコイドコロニーの成長が誘導されます。液体媒体と固体媒体の両方における重炭酸ナトリウムの最終濃度は0.8%です。
- 50%オートクレーブ滅菌BHIブロス、40%FBS、および10%重炭酸ナトリウム溶液(v / v)を混合して、炭疽菌の培養ブロスを調製します><。
手記：このブロスは、カプセル化された桿菌の短鎖を生成するように配合されています。
- 炭疽菌のマスタープレートを、胞子ストックからNBY寒天プレートで分離するためにストリーキングすることにより、ブロスで培養します。37°Cでインキュベートします。
- 30 mLの培養液を、炭疽菌のいくつかのコロニーを含む通気孔のある250 mLフラスコに接種します
手記：ここで指定されているように、ブロスの特定の体積対表面比は、最大限にカプセル化された桿菌を生成するために必要です。
- ブロス培養物を125rpm、37°C、20%CO2、湿度18〜24時間で振
手記：炭疽菌を37°Cを超える温度で増殖させると、カプセルの生成が阻害される可能性があります。
- インディアインクによるネガティブ染色を使用して、十分なカプセル化を確保し、固定前に桿菌が短鎖(1〜5桿菌/鎖)にあることを確認します(セクション2を参照)。
- コロニー形成単位(CFU)を測定するには、100 μLの培養物をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液で1:10に連続希釈し、ヒツジの血液寒天プレートで培養希釈液をプレート培養します。37°Cで12〜18時間インキュベートし、CFUをカウントし、培養物1mLあたりの細菌数を決定します
手記：カウントは、細菌が固定されたら、顕微鏡下の血球計算盤を使用して行うこともできます。ただし、低倍率では桿菌が見づらいため、これはお勧めできません。
- 16%パラホルムアルデヒド(PF)を最終濃度4%PFで細菌培養の全量に添加して、桿菌を固定します。周囲温度のシェーカーで7日間ゆっくりと攪拌します.
手記：4% PF での 7 日間のインキュベーションは、栄養桿菌を固定するための米国陸軍感染症医学研究所 (USAMRIID) の機関標準操作手順に基づいています。
- 固定剤を除去し、無菌性をテストするには、50 mLコニカルチューブ内の固定細菌懸濁液4 mL(10%容量)を、≥3000 x gで45分間遠心分離し、PBSで30 mL /洗浄して3回洗浄します。残りのサンプルを 4% PF で 4 °C.
で保存します。
手記：ペレット化後、バクテリアペレットはカプセルの存在によりふわふわしています。洗浄中にペレットを乱さないように注意してください。生存率試験に支障をきたさないように、すべての固定剤を除去する必要があります。必要に応じて、洗濯の回数を増やしてください。
- 生存率試験では、40 mLの細菌増殖培地(BHIブロスなど)に4 mLの洗浄懸濁液(ブロス容量の≤ 10%)を接種し、37°Cで7日間インキュベートします。7日前後に600nmの光学濃度を確認し、濁度を測定します。
- ブロス培養物で7日間インキュベートした後、≥100μLのブロスを寒天プレートにプレートし、さらに7日間インキュベートします。濁度の増加やプレート上の成長が見られない場合、元の培養物は無菌と見なされ、BSL-2ラボに移すことができます
注:Federal Select Agent Programでは、不活化炭疽菌は、サンプルの完全な無菌性を実証した後にのみBSL-3研究所から移送することを義務付けています。不活化炭疽菌の生存率試験は、サンプルの10%をブロスで7日間培養し、続いて固体培地でさらに7日間培養することで構成されます。無菌性が確立されたら、施設のガイドラインに従って移植承認を受けてください。
2. 内包と桿菌鎖を観察するためのネガティブ染色と光学顕微鏡
- 顕微鏡スライドで5 μLの細菌懸濁液と2 μLのインドインクを混合します。気泡を出さずに、厚さ1または1.5μmのカバーガラスを懸濁液の上に置きます.
手記：マニキュアを使用して、カバーガラスをスライドに密封することができます。
- 光学顕微鏡で40倍から100倍の油対物レンズを使用して細菌懸濁液を観察します。各細菌を囲むクリアランスゾーン(カプセルはインドインクを除く)を観察して、桿菌がカプセル化されていること、および桿菌鎖が短いことを確認してください。
>3. 細菌のFITC標識
- フルオレセインイソチオシアネート(FITC)をジメチルスルホキシドに2 mg / mLの濃度で溶解します。.
- 不活化細菌ストックの量を測定します。
- ストックをPBSで3回洗浄して、固定剤を取り除きます。
- 最終濃度75 μg/mLのFITC溶液を添加します。混合物を4°Cで18〜24時間ゆっくりと攪拌します。
- ≥3000 x gでペレット化して45分間、30 mLのPBS/洗浄液を使用して余分なFITCを除去し、細菌を3回洗浄します。洗濯中にふわふわのペレットが邪魔されないように注意してください。桿菌をPBSに同じ開始量で再懸濁します。
- 桿菌は分注し、使用まで-20°Cのマイクロチューブに保管します。桿菌がカプセルを失う可能性があるため、何度も凍結/解凍しないでください。
4. 細菌のオプソニン化
- 少量の試験血清(非ヒト霊長類、NHP由来)を56°Cで30分間ヒートブロック内で不活化します。
- FITC標識細菌をPBS 2xで解凍し、15000 x gで3〜5分間ペレット化して洗浄し、同じ開始容量でPBSに再懸濁します。
- 96ウェルの丸い底板(プレート#2)で、細胞培地中の試験血清を連続希釈します。別の96ウェル丸底板(プレート#3)で、希釈したテスト血清10μLを各ウェルに加えます
手記：すべてのプレートに、PBSおよび正常なサル血清が、陰性対照として希釈されたテスト血清の代わりに含まれていた。また、異なる日に行われたすべてのアッセイを標準化するための標準曲線を生成するために、1つの検査血清を陽性対照として選択しました。陽性対照検査用血清は、豊富にあったため任意に選択しました。
- プレート#3に、再構成したばかりの赤ちゃんウサギ補体10μLを加えます
手記：再構成したら、残りの赤ちゃんウサギの補体を廃棄します。再凍結して解凍しないでください。
- プレート#3に、1:20の感染の多様性のために適切な量のFITC標識桿菌を追加します。例えば、5 x 104 x 20 桿菌を含むボリュームを 5 x 104 細胞に追加します。プレート#3の各ウェルに、適切な量の細胞培地を合計105 μL.
で補充します。
手記：細胞を含むプレート#1は、100μLのオプソニン化細菌を受け取り、残りの5μLをボイド容量として受け取ります。試験血清の各希釈度を二重に試験しました。
- プレート#3を5% CO2の存在下で37°Cで30分間インキュベートし、湿潤でバチルスをオプソニン化します。
>5.哺乳類細胞のアドヒアランスアッセイと蛍光標識
- 使用前にすべての試薬を37°Cに維持してください。
- 接着細胞を含むプレート#1を37°Cのヒートブロックの上に置きます。
- マルチチャンネルピペッターを使用して、使用済みの培地をウェルから取り出し、プレート#3から100 μLのオプソニン化細菌とすばやく交換します。ピペッティング中にウェルに気泡が発生していないことを確認してください。プレート#1を37°C、5% CO2、湿度30分間インキュベートして接着します。
- 37°Cのヒートブロックの上に150μLのPBSを150μLで各ウェルを5回洗浄し、付着していない桿菌を取り除きます
手記：洗浄中に細胞が誤って分散しないように注意する必要があります。
- 16% PFをPBS 1:4で希釈して4% PFを作製し、各ウェルに150 μLを加えて細胞を4% PFで1時間固定します。細胞をPBSで2回洗浄します。
- 2 μL HCS(ハイコンテントスクリーニング)Orange Cell Stainを10 mL PBSに混合します。この染色液150 μLを固定細胞に加え、常温で30分間インキュベー
トします。
- PBSでウェルを2回洗います。
- 顕微鏡検査まで4°Cで保存してください。
6. 顕微鏡
>注:一般的に、ハイスループットの自動蛍光顕微鏡はOAAのイメージングを容易にします。自動システムが利用できない場合は、付着性桿菌の蛍光画像を手動で取得できます。この研究では、付着性桿菌と細胞単層を、特殊な機器を備えたZeiss 700レーザー走査型顕微鏡システムを使用して画像化しました。当社のシステムは、自動ステージを搭載したZeiss Axio Observer Z1倒立顕微鏡、Definite Focusモジュール、40 x NA 0.6対物レンズ、Axio Cam HRcカメラ、Zen 2012(Blue Edition)ソフトウェアで構成されていました。取得された画像は広視野画像であり、共焦点画像ではありません。以下のプロトコルは、さまざまな自動顕微鏡システムに適用可能な基本的な顕微鏡セットアップとして意図されています。
- プレート#1を常温で30分間インキュベートし、顕微鏡および関連機器のスイッチを入れます
手記：周囲温度での順応により、イメージング中にガラス板に結露が発生するのを防ぎます。また、温度変化によるピントぼけも防止します。
- プレートをステージ上に置き、明視野または位相コントラストを使用して細胞に焦点を合わせます。
- プレート設定として96ウェル形式を選択します。チャンネル設定を選択します.
手記：FITCのピーク励起波長と発光波長は495/519nmです。HCSオレンジ細胞染色は556nmおよび572nmです。他の蛍光色素は、顕微鏡で利用可能なフィルターに応じて使用できます。
- タイルモードへの設定を選択します。取得する画像の数を示します。
手記：タイリング機能では、サンプルウェル内の複数の位置をキャプチャでき、タイリング形式またはランダム形式で画像を取得するように設定できます。井戸ごとに10のランダムな領域を画像化しました。
- 取得モードを「白黒」または「モノクロ」に変更し、ビニング≥2x2.
手記：ビニングを1x1から2x2または4x4に設定すると、顕微鏡観察の速度は向上しますが、画像の解像度も低下します。OAAの場合、アッセイはマクロファージと付着細菌の両方を列挙するため、これらの設定を使用するだけで十分です。
- オートフォーカスまたはフォーカスモジュールをオンにします。オートフォーカス機能を実行する頻度を示します。Z スタック機能をオンにします (使用可能な場合)。細胞単層と付着性桿菌の厚さを捕捉するZスタックの数を示します。
手記：選択したZスタックの数により、顕微鏡観察時間は長くなりますが、各Zスタックで正しい焦点の画像が撮影されます。
- 画像を保存するファイルフォルダを指定します。自動イメージングプログラムを実行します。