光活性化ペプチドMHCによる制御されたT細胞活性化の評価

要約

出典:Sanchez, E., et al.光活性化アゴニストを用いたT細胞活性化の空間的および時間的制御。J. Vis. Exp.(134), (2018年)

このビデオは、UV照射を使用して光活性化可能なペプチド-主要組織適合遺伝子複合体をデカジッジする方法を示しています。デカジングプロセスにより、天然のペプチド配列が露出し、正確なT細胞の活性化が可能になります。

プロトコル

1. 刺激性ガラス表面の調製

1. 8ウェルチャンバーのカバーガラスに、蒸留脱イオン水(ddH₂O)で1:500に希釈したビオチン化ポリ-L-リジン(Bio-PLL)を塗布します。室温(RT)で30分間インキュベートします。
2. _H2Oで洗浄します。
3. RTで2時間乾燥させます。
4. ブロッキングバッファー(HEPES緩衝生理食塩水[10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl]、2% BSA含有)でBio-PLLコーティング表面を室温で30分間ブロックします。
   1. 5 mgのポリ-L-リジン臭化水素酸塩を1 mLの10 mM NaPO4、pH 8.5に溶解します。
   2. 125 μmol(0.55 mg)のNHS-ビオチン(DMSO中の100 mg/mLストックから)を添加し、反応のpHを確認します。pHが8.5未満の場合は、4 N NaOHを2 μL加えてpH 8.5から9.5の間に上げます。
   3. 30分間渦
   巻きます。
   4. 50 μLの100 mMグリシンを20 mM Tris pH 8.0に溶解して反応をクエンチします。
   5. 10分間フルパワーで回転し、上清を新しいチューブに移します
      注:Bio-PLLの品質は、通常、96ウェルELISAプレートに材料の連続2倍希釈をコーティングし、アルカリホスファターゼ共役ストレプトアビジンとのインキュベーション後にビオチン含有量を定量することにより、以前の調製物と比較されます。
5. ブロッキングバッファを取り外します。井戸を乾かさないでください。ストレプトアビジン(ブロッキングバッファー中100 μg/mL)を添加します。4°Cで1時間インキュベートします。
6. HBSで洗ってください。チャンバースライドウェルを4〜5回充填および反転させ、ウェルからHBSを取り除きます。井戸を乾かさないでください。
7. ビオチン化pMHCリガンドと接着分子を表面に加えます.
   手記：MCCおよびOVAは、オルトニトロベンジルベースの保護基(ニトロフェニルエチル(NPE)またはニトロベラトリロキシカルボニル(NVOC)など)を主要なリジンのε-アミノ基(MCCのK12、OVAのK7)に添加することで光ケージ化できます。フォトケージされたMCCおよびOVAは、商用ベンダーから入手できます。水性緩衝液で再構成した後、確立されたアプローチを使用して、細菌に発現するI-E^kおよびH2-K^bに再フォールディングされます。
8. 光活性化可能なMCCまたはOVAペプチドの検証
   1. ハンドヘルドUVランプ(材料表を参照)でUV照射することにより、NVOCで保護されたペプチドを室温で20分間ディケージします。
   2. 1 μM の非刺激性ペプチド (ネガティブコントロール、Hb など)、非照射光活性化ペプチド、照射光活性化ペプチド、およびアゴニストペプチド (ポジティブコントロール、MCC など) で 1.0 x 10⁵ APC をパルス 1 時間から 37 °C で一晩
   。
   3. 5Cを発現するT細胞を刺激する。C7/2B4/およびTCRは、CH12またはCH27 B細胞を使用します。OT1 T細胞を刺激するには、RMA-sまたはEL4胸腺腫細胞を使用します。
   4. パルスAPCを96ウェル丸底プレートで同数のT細胞と混合し、最終容量200 μLで37°Cで12〜24時間インキュベートします。
   5. 各ウェルから上清を回収し、ELISAによるIL-2のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ比色検出で分析します
      注:MHC複合体に再フォールディングする前に、エレクトロスプレー質量分析によるすべてのペプチドのケージ状態の確認を強く推奨します。
9. MHCの折り畳みと精製を行い、光への曝露を最小限に抑えます。例えば、フォールディング反応をアルミホイルで包み、UVランプをオフにしてゲルろ過クロマトグラフィーを行います
   手記：光活性化可能なMCC-I-E^kおよびOVA-H2-K^bは、おそらく機能的ケージが不完全であるために、高密度でUV非依存性T細胞の活性化を誘導することがわかっています。したがって、光活性化可能なpMHCは、固定化ステップ中に10〜30倍の過剰の非刺激性pMHC(例えば、ヘモグロビンペプチド(Hb)を含むI-E^k)に希釈されます。これにより、その後のイメージング実験のS/N比が向上します。
10. CD4⁺ T細胞を光活性化するには、ビオチン化Hb-I-Ek(3 μg/mL)、ビオチン化光活性化可能なMCC-I-E^k(0.1 μg/mL)、およびクラスI MHC H2-K^k(0.5 μg/mL)に対するビオチン化抗体の混合物を併用します。抗H2-Kk抗体は5Cを促進します。H2-K^kを発現するC7/2B4/ANDT細胞は、活性化することなくガラス表面に広がります。
11. CD8⁺ T細胞には、ペプチドKAVYDFATLを含むビオチン化H2-Db(1 μg/mL)、ビオチン化光活性化可能なOVA-H2-Kb(0.1 μg/mL)、接着分子ICAM-1の細胞外ドメイン(昆虫細胞培養で産生される2 μg/mL)の混合物を使用します。ICAM-1は、インテグリンLFA1をT細胞表面に噛み合わせることで、密接な接触形成を促進します。
12. すべてのタンパク質混合物をブロッキングバッファーに適用し、その後、室温で1時間、または4°Cで少なくとも2時間インキュベートします
    手記：この種の表面上の分子密度は、μm2あたり~8000であると以前に決定されています。光活性化可能なpMHCが表面上のビオチン化タンパク質の~1/30を占めることを考えると、その密度はデカジッキング前にμm2あたり~267分子になります。
13. 手順1.6と同様に洗浄し、使用する準備ができるまでHBSに置いておきます。
14. 適切なTCRを発現する200,000個のCD4⁺またはCD8⁺ T細胞を各ウェルに加え、細胞を37°Cで15分間接着します。細胞が表面に付着して広がると、光活性化とイメージングの準備が整います.
    手記： 蛍光イメージングプローブによるエフェクターT細胞のレトロウイルス形質導入については、他の場所で詳細に説明されています。カルシウムシグナル伝達は、カルシウム感受性色素Fluo-46をロードした形質導入されていないT細胞を使用して研究することもできます。レシオメトリック色素Fura-2は、UV領域での励起を必要とし、光活性化可能なpMHCのデケージも誘導するため、推奨されません。

2. 画像取得

1. 画像取得には、UV対応の150倍対物レンズを装備した倒立TIRF顕微鏡を使用します。100W水銀ランプ(HBO)に取り付けられたデジタルダイアフラムシステムを使用して、ユーザー定義の領域をUV照射します。このランプからのUV光は、400nmのロングパスミラーを使用してサンプルに向けられます。
2. 画像解析ソフトウェアを使用して、局所的な光活性化とタイムラプス取得を行います。ほとんどの実験では、488 nmと561 nmの励起レーザーをそれぞれ使用して、緑と赤の両方のチャンネルでプローブをモニターします。レーザー光は、UV領域でも透過するデュアルバンドパスダイクロイックミラーを使用してサンプルに向けられます(デケージを可能にするため)。顕微鏡の構成の詳細については、材料表と図1を参照してください。
3. T細胞を封入したチャンバースライドを装着した後、必要に応じてTIRFまたは落射蛍光照明を得るための設定を調整します。ライブモードで、目的の蛍光プローブを発現している細胞のフィールドを選択します。ソフトウェア制御により、個々の細胞の下に光活性化のためのミクロンスケールの領域を確立します。
4. タイムラプス撮影を開始します。通常、80 個のタイム ポイントが取得され、各タイム ポイント間の間隔は 5 秒です。これにより、デュアルカラー実験の場合、488 nmおよび563 nmの連続露光に十分な時間が残されます。
5. 10時間経過した後、デジタルダイヤフラムシャッターを1〜1.5秒間開いて、選択した領域を光活性化します。
6. タイムラプスが完了したら、新しいセルのフィールドを選択し、プロセスを繰り返します。

結果

図1:光活性化およびTIRFイメージングのための顕微鏡構成。

488 nmおよび561 nmレーザーは、それぞれ緑色および赤色プローブのTIRFおよび脱毛蛍光イメージングに使用されます。光活性化用のUV光は、ユーザー定義の小さな領域を照らすことができるデジタルダイアフラムシステムに取り付けられた水銀(Hg)ランプから取り出されます。Hgランプ/ダイアフラムからの光は、イメージングレーザーを反射するダイクロイックミラーの下に配置されたロングパスミラーによってサンプルに反射されます。ダイクロイックミラーは、UV光を通すように設計する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Nunc Lab-Tekチャンバーカバーグラス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	155361
ポリ-L-リジン臭化水素酸塩	シグマ・アルドリッチ	P2636	ビオチン化ポリ-L-リジンを作る必要があります
EZ-Link NHS-ビオチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	20217	ビオチン化ポリ-L-リジンを作る必要があります
ストレプトアビジン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	434301
BirA-500:BirAビオチン-タンパク質リガーゼ標準反応キット	アビディティ	バーA500	タンパク質のビオチン化に使用されます
ビオチン化Hb I-EK			タンパク質のフォールディングについては、参考文献6を参照してください。ビオチン化には、BirAキットを使用してください
ビオチン化NPE-MCC I-EK	アナスペック		カスタムNPE-MCC(HANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATKOH)はAnaspecから購入できます
ビオチン化αH2-Kk抗体	BDバイオサイエンス	553591
ビオチン化NPE-OVA H2-Kb	アナスペック		カスタムNPE-OVA(H-SIINFE- K(Nvoc)-L-OH)はAnaspecから購入できます
ビオチン化ケイビーH2-DB	アナスペック		カスタム合成タンパク質(KAVYDFATL)はAnaspecから購入できます
ビオチン化ICAM1			タンパク質のフォールディングについては、プロトコールの参照を参照してください。ビオチン化には、BirAキットを使用してください
ハンドヘルドUVランプ	UVPの	UVGL-25	ランプはサンプルから 1 cm < cm 離して保持します。検出可能なデカージングには 365 光の 30 秒、定量的デカージングには 20 分で十分です。
オリンパスIX-81 OMAC TIRFシステム。	オリンポス		イメージングシステムの詳細については、図6を参照してください
モザイクデジタルダイアフラム	アンドール
スライドブックソフトウェア	インテリジェントイメージングのイノベーション