$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ヒトCD4+ Th1エフェクター/メモリーT細胞の調製
- ドナーの腕に止血帯を当て、アルコールで静脈を拭き、針を刺します。EDTAを抗凝固剤として使用して、15mlの血液をゆっくりとバキュテーナーに引き込みます。採血が終わったら、針を抜く前に止血帯をほどいてください。針を抜いたら、すぐに滅菌ガーゼで傷口に圧力をかけます。
- 50mlのチューブに血液を移します。RPMI-1640をRTで1:1希釈(最終容量30 mL)で加えます。希釈した血液を、RTのFicoll-Paqueなどの15 mlのろ過済みリンパ球単離培地を含む2本の50 mlチューブに慎重に重ねます。
- スイングバケットローターで、1,200 x gでRTでグラジエントを30分間遠心分離します。遠心分離中に、T細胞培地(RPMI-1640 500 ml、FCS50 ml、ペニシリン/ストレプトマイシン5 ml)を調製します。
- 遠心分離機から50 mLのチューブを取り出したら、底の赤血球のペレット、白血球(リンパ球を含む)を含む細胞の層であるパク、および血漿の4つの層を観察します。パスツールピペットで白血球層を慎重に取り除き、50mlのファルコンチューブに移します。
- RT RPMI-1460(最大20 ml)を添加し、RTで1,200 x gで5分間遠心分離することにより、白血球層を洗浄します。1.5 mLの遠心チューブに1 mLの細胞懸濁液5 μlを250 μLのT細胞培地に加え、ピペットで穏やかに上下に混合します。
- 希釈した細胞懸濁液25 μLを0.4% Trypan blue25 μLに加えます。標準血球計算盤の両側に10 μlの混合物を加えます。
- 血球計算盤を低倍率の光学顕微鏡に置きます。10倍の対物レンズを使用して、トリパンブルー色素を除外し、血球計算盤の両側の中央の正方形に存在する生細胞の数をカウントします。
- 細胞濃度を計算するには、2つの正方形の平均に100(希釈係数)を掛け、次に10:4を掛けて細胞数/mlを求めます。
- 最終濃度をT細胞培地中の0.5 x 106細胞/mLに調整します。最終濃度1 μg/mLの細菌性スーパー抗原ブドウ球菌性エンテロトキシンB(SEB)およびトキシックショック症候群毒素1(TSST)をそれぞれ1 μg/mLの細胞に加えます。72時間(37°Cおよび5%CO2)培養して、CD4+ T細胞集団を拡大します。
- T細胞(1,200 x g、5分)をペレット化し、ヒトIL-15(20 ng/ml)を添加してT細胞培地中に0.5 x 106細胞/mLで再懸濁します。リンパ球をT150フラスコに移します。必要に応じて、24〜48時間ごとにフルミディアムIL-15で細胞を増殖/分割し続けます(メディアの色に基づく;つまり、メディアがピンクからわずかに黄色に変わるたびに)その後。得られたリンパ球集団を最大15日間維持します.
手記：設計上、このプロトコルは、SEBおよびTSSTに反応するCD4+ T細胞のサブセットを特異的に活性化および増殖させ、それらをTh1様エフェクター/記憶表現型へと駆動します。他の白血球は、これらの条件下では生存および増殖することができず、ステップ1.10までに、細胞は少なくとも95%のCD4+、CD45RO+ T細胞となり、フローサイトメトリーによって容易に評価することができる。必要に応じて、市販の抗体/磁気ビーズベースのポジティブまたはネガティブ選択キットを通じて、さらなる精製を容易に達成することができます。
>2. 初代ヒト内皮細胞培養の開始
- T25フラスコにフィブロネクチン(FN)20 μg/mlをPBSで無菌状態でコーティングします。RTで30〜60分間放置します。FNを取り出し、5 mLの完全培地(Endothelial Basal Medium(EBM-2)培地にEndothelial Growth Medium(EGM-2)シングルクォートを添加)を加えます。37°Cの細胞培養インキュベーターで少なくとも30分間プレインキュベートします。
- 凍結したヒト肺または真皮微小血管内皮細胞(HLMVECまたはHDMVECs)のバイアルを37°Cの水浴で解凍し、時折穏やかに攪拌しながら~2〜3分間、予め温めた培地を含むT25フラスコに細胞を直ちに移します。穏やかに渦を巻いて、37°Cのインキュベーターに入れます。
- プレートが~90-95%のコンフルエントに達するまで、約48時間ごと(またはメディアがわずかに黄色になったら)メディアを交換し続けます。
3. 内皮細胞の一般的な分裂と拡大
- 細胞を~90-95のコンフルエンシーに増殖させます。これには2〜5日かかる場合があります。分割する場合は、メディアを取り出し、PBSですすいでください。PBSを取り外し、最小量の新しい1xトリプシン(T25の場合は0.5 ml、T75の場合は1.5 ml)と交換します。穏やかに渦を巻いて、すべての表面をトリプシンで覆います。37°Cで~5分間インキュベートします。プレートからの細胞の剥離を、低倍率の光学顕微鏡で観察します。
- 細胞の大部分が丸みを帯びているか、または剥離しているように見える場合は、予め温めた完全なEGM-2培地の5容量(つまり、追加されたトリプシン容量と比較して)を追加し、フラスコの表面を静かにピペットで動かしてすべての細胞を分離します。
- 1.6-1.7で説明されているように、血球計算盤で内皮細胞をカウントします。遠心分離(5分、1,200 x g)により細胞をペレット化します。上清を取り除きます。予め加温した完全EGM-2 MV培地を添加することにより、濃度を1mlあたり50万細胞に調整します。
- 細胞のアリコートを適切なFNコーティング皿またはフラスコに移し、メンテナンスを行います。静かに渦を巻いてインキュベーターに入れます。メッキから6〜12時間以内にメディアを交換してください。その後、メディアは約48時間ごとに交換する必要があります。
4. 内皮細胞トランスフェクション
>注:初代内皮細胞は、最も一般的な化学的およびエレクトロポレーション法によるトランスフェクションに抵抗性です。以下で説明する核トランスフェクションベースの方法では、比較的高いトランスフェクション効率(50~70%)が得られます。効果的な代替方法は、適切なウイルスベクターによる感染の使用です(材料表のコメントを参照)。
- HLMVECまたはHDMVECのT25またはT75フラスコ(必要に応じて)を、最終密度が90〜95%の密度になるまで調製します。無菌条件で、Delta-Tプレートなどの顕微鏡培養プレート(ステップ5の場合)または24ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置された12mm円形ガラスカバースリップ(ステップ6の場合)のいずれかで、PBS中のフィブロネクチン(FN)20ug / mlを上記(2.1)でコーティングします。
- 1 mLの完全EGM-2培地を顕微鏡培養プレートに加えるか、各24ウェルに0.5 mLを加え、加湿した37°C/5%CO2インキュベーターでプレートを平衡化します。
- ステップ3.1-3.3のように内皮細胞を採取し、カウントします。必要量の細胞(サンプルあたり50万細胞)を1,200 x gで5分間RTで遠心分離し、サンプルあたり100 μlのRT核トランスフェクション溶液に細胞ペレットを慎重に再懸濁します。
- 100 μlの細胞懸濁液と1-5 μgのDNAを組み合わせます。細胞/DNA懸濁液を認証キュベットに移します。サンプルは気泡なしでキュベットの底を覆う必要があります.
注:YFPまたはDsRedを細胞膜に標的とするコンストラクト(翻訳後パルミトイル化のシグナルを含むニューロモジュリンのN末端20アミノ酸を介して)を単独で使用(膜-YFP単独または膜-DsRed単独)または細胞質体積マーカー(例えば、膜-YFPおよび可溶性DsRed)と同時トランスフェクトした。蛍光タンパク質マーカーの多くの順列を使用することができます。
- キュベットをキャップで閉じます。細胞/DNA懸濁液入りキュベットをエレクトロポレーターのキュベットホルダーに挿入し、エレクトロポレーションプログラムS-005を適用します。プログラムが終了したら、キュベットをホルダーから取り出します。
- ~500 μlの平衡化済み培地をキュベットに加え、核トランスフェクションキットに付属のプラスチック製トランスファーピペットを使用して、キュベットから細胞懸濁液を静かに取り出します。
- 顕微鏡培養プレートを用いた実験では、1つの反応による細胞懸濁液を、予め加温した培地を含む2つの皿に均等に分配します(ステップ4.2-4.3)。24ウェル/プレートを使用する実験では、1つの反応を3つのウェル間で均等に分割します。
- 加湿した37°C/5%CO2インキュベーターで細胞をインキュベートし、トランスフェクション後4〜6時間、およびトランスフェクション後12〜16時間で再度培地を交換します。
>5. ライブセルイメージングと解析
- Endotheliumの準備
- 0日目:ステップ4で説明したヌクレオフェクション技術を介して、一次HLMVECをメンブレンYFPおよび可溶性DsRedと共トランスフェクションし、生細胞イメージング培養プレートにプレート化します。
- 1日目:培地をIFN-γ(100 ng/ml)を含む新しい培地と交換して、MHC-II発現を誘導します。2日目。既存の培地に20 ng/mLのTNF-αを添加することにより、トランスフェクションされた細胞を刺激します。
- 3日目に、実験の直前に、細菌性スーパー抗原ブドウ球菌エンテロトキシンB(SEB)およびトキシックショック症候群毒素1(TSST)をそれぞれ1 μg/mlずつインキュベートします。37°Cで30〜60分間。'-Ag' 制御条件では、この手順を省略します。
- リンパ球の調製
- ステップ5.1.3と並行して、20 mM HEPES、pH 7.4、および0.5% v/vヒト血清アルブミンを37°Cに予熱したバッファーA(フェノールレッドフリーHBSS)を調製します。培養リンパ球のサンプルを採取し、血球計算盤でカウントして密度を決定します(ステップ1.12-1.17)。
- 15 mLのコニカルチューブ内で、1,200 x g、RTで5分間、サンプルあたり200万個の細胞を遠心分離します。培地を吸引し、細胞クラスターが残らないように、細胞ペレットを2 mLのバッファーAに穏やかに再懸濁します。
- Fura-2カルシウム色素の新鮮なアリコートを取り出し、DMSOに再懸濁してストック濃度を1 mMにします。
- T細胞懸濁液(最終濃度2 μM)に2 μlのFura-2ストック溶液を加え、チューブにキャップをし、チューブを反転させてすぐに混合すると、色素が均一に分散します。37°Cで30分間インキュベートします。
- ステップ5.2.2と同様に遠心分離します。Buffer-Aを吸引し、リンパ球を20-40 μlの新鮮なBuffer-Aに穏やかに、しかし完全に再懸濁します。
- ライブセルイメージングのセットアップと取得
注:直立型および倒立型光学顕微鏡での生細胞蛍光イメージングには、さまざまなシステムを使用できます。基本的な要件には、蛍光光源とフィルター、CCDカメラ、電動フィルター切り替えとシャッター、加熱ステージ(または顕微鏡に取り付け可能な加熱チャンバー)、および自動画像取得用のソフトウェアが含まれます。このプロトコルでは、必要な空間分解能を達成するために、高開口数と高倍率(40倍、63倍)の油浸レンズが必要です。Fura-2ベースのカルシウムイメージングに適した蛍光源とレンズを選択する際には、すべてが必要な340/380nmの励起波長と互換性があるわけではないため、特別な注意を払う必要があります。別のアプローチ(標準的な緑色および赤色の蛍光フィルターセットと互換性がある)は、非レシオメトリックカルシウム感受性色素(Fluo-4、Rhod-3など)で使用できますが、カルシウムフラックスを正確に定量することはできず、相対的/定量的な読み出しのみを提供します。
- 顕微鏡システム(操作用PC、顕微鏡、CCDカメラ、フィルターホイール、キセノンランプ)の電源を入れます。
- 指定されたソフトウェアを開きます。
- 自動マルチチャンネルタイムラプスイメージング用の顕微鏡/ソフトウェアをセットアップします。微分干渉コントラスト(DIC)、標準緑色蛍光、標準赤色蛍光、および標準340nmおよび380nm励起Fura-2画像のシーケンシャル取得が含まれます。取得の間隔を 10 〜 30 秒、合計時間を ~20 〜 60 分に設定します。
- Fura-2イメージングの露光時間を設定します。
- 新しい対物レンズオイルを加え、0.5 mLのBuffer-Aのみを含む顕微鏡ディッシュを加熱ステージアダプターにセットし、すぐにオンにして37°Cに平衡化します(2~3分かかります)。
- 静止しているFura2をロードしたリンパ球を、20 μlピペットを使用して、マウントされた顕微鏡ディッシュチャンバーに加えます。
- 明視野イメージングをオンにします。接眼レンズへの光路を選択します。粗いフォーカスノブを使用して、対物レンズを顕微鏡皿の底に接触させます。接眼レンズとファインフォーカスノブを使用して、皿の底に沈殿したT細胞に焦点を合わせます。
- x-y ステージ・コントロールを使用して、少なくとも 10 個のセルを含むフィールドを選択します。過密なフィールドや細胞の塊は、イメージングアーティファクトを作成するため、避けてください。
- 明視野から蛍光灯に切り替えます。接眼レンズイメージングからCCDカメラに切り替えます。集録パラメータ(露光時間、検出器ゲイン、ビニングなど)を設定します。このソフトウェアを使用して、静止中のFura2-340およびFura2-380の画像を取得します(それぞれ同じ露光時間から開始し、通常は200~1,000ミリ秒の範囲)。
- ステップ5.4.1で説明した方法を使用して、各リンパ球のFura2-340/Fura2-380を計算します。Fura2-340 と Fura2-380 の露光時間の調整、画像の取得、比率の計算を繰り返して、平均値が 1 に近づくまで
繰り返します。
- mem-YFPとDsRedの露光時間を設定します。
- ステップ5.3.3.1で使用した顕微鏡ディッシュを、細胞培養インキュベーターからのトランスフェクション、活性化、およびSAg処理(または未処理;コントロール)HLMVECまたはHDMVECを含む顕微鏡ディッシュと交換します(ステップ4.5.1)。使い捨てのトランスファーピペットを使用して培地を迅速に除去し、予熱したBuffer-Aを~1ml加えて1回すすぎます。吸引し、0.5 mLのBuffer-Aを加えます。
- 明るく蛍光を発する陽性トランスフェクタント内皮細胞が存在し、細胞間接合部が整った健康に見えるフィールドを特定します。
- mem-YFPおよびDsRedの集録パラメータ(露光時間、検出器ゲイン、ビニングなど)を調整します。各チャンネルの平均蛍光シグナル強度が、検出器のダイナミックレンジの25%から75%の間にあることを確認してください。
- 生細胞イメージング実験を実施します。
- 自動化されたソフトウェアを使用して画像取得を開始し、いくつかの間隔の画像をキャプチャしてベースラインを確立します。
- 取得時には、少量のピペット (P-5 または P-20) の先端を対物レンズの中心に近い培地に挿入し、ゆっくりと排出することにより、濃縮された Fura-2 をロードしたリンパ球 (ステップ 5.2 から) を顕微鏡ディッシュイメージングフィールドの中心に注入します。
- リンパ球がイメージングフィールドに落ち着くと、T細胞と内皮細胞のインターフェース(免疫学的シナプス)が焦点面に維持されるように、焦点を微調整します。40倍および63倍の対物レンズでは、フィールドあたり~10-20個のセルが最適です。イメージングフィールドで観察される細胞が少ない場合は、手順5.3.4.2を繰り返します。
- 実験の所望の観察間隔が完了した後、イメージングを続行し、直ちにイオノマイシンを顕微鏡皿に直接ピペットで入れ(5.3.4.2のような手法を使用)、最終濃度2μMまでして、最大のカルシウムフラックス/Fura-2シグナル伝達シグナルを誘導する(すなわち、キャリブレーションの手段、分析5.4.を参照)。