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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
>1. 乳がん発症のトランスジェニックマウスモデル
- 目的のがんモデルのマウスを観察し、触診またはキャリパー測定で適切な腫瘍増殖を確認してから進めてください。
手記：ここでは、乳がん発症のトランスジェニックマウスモデル(FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J)(MMTV-PyMT)を用いた。これらの動物は、各乳腺で生後6週から12週の間に浸潤性乳がんを自然に発症します。正常な乳腺を、導入遺伝子陰性の年齢一致同腹仔からの対照として使用した。
>2. 特異的および非特異的抗体の静脈注射
- ウサギ抗マウスB7-H3およびウサギ免疫グロブリンG(IgG)アイソタイプコントロール抗体を脱塩カラム(PD-10など)で精製し、メーカーの指示に従って保存剤および保存バッファーを除去します
手記：一部の抗体は、Protein-Aアガロースビーズベースのプロトコルでさらに精製が必要な場合があります。
- 各抗体コンジュゲートの33 μgの分量を個々の微量遠心チューブに充填します
手記： 投与される薬剤の投与量は、アプリケーションによって異なり、抗体標識が日常的に使用される投与量と一致します。動物の安全のために、容量が100μLを超える場合は、抗体溶液の濃度が必要です。
- 組織収集の前の所望の時点、ここでは96時間で、2L/minで酸素中を流れる2%イソフルランで腫瘍担持動物に麻酔をかけ、37°Cの加熱ステージに置く。手順の前に、つま先をつまんで、適切な麻酔レベルに達したことを確認します。
- 抗体溶液の尾静脈接種の準備として、動物の尾部をアルコールワイプで3回拭いて消毒します。尾静脈をヒートパッドで約30秒間温めて拡張します。動物全体を加熱することは避けてください。ヒートパッドを取り外した後、もう一度アルコールワイプでテールを拭きます。
- 27G尾静脈カテーテルを使用して、バタフライ針を2つの外側尾静脈のいずれかに挿入し、挿入された針で尾を手術用テープでステージに慎重に固定します
手記：カテーテルへの目に見える血液の逆流は、尾静脈内の針の適切な位置を示しています。
- 25 μL の滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でカテーテルを洗い流し、インスリン注射器を使用して抗体溶液をカテーテルに注入します。カテーテルを25μLの滅菌PBSで再度洗い流します。
- 尾から針を取り外し、圧力をかけて出血を止めます。
- 麻酔をオフにし、苦痛の兆候がないか完全に目が覚めるまで動物を観察します。
3. 標的腫瘍組織の採取と調製
- 所望の時点で、許容される制度的手順に従って、ここでは、チャンバー変位流量が10〜30%の体積/分
の圧縮ガスタンクから100%CO2を徐々に吸入することにより、動物を人道的に安楽死させます
手記：IVIL技術の一部の用途では、自由に循環する抗体を除去するために、PBSによる心臓灌流による安楽死が必要です。
- 呼吸運動と心臓運動の停止、つま先のつま先つまみ反応の欠如、および粘膜の灰色化による人道的な安楽死が確認された後、次のように外科用ハサミと鉗子を使用して腫瘍組織を切除します。
- マウスを仰臥位に置き、鉗子で尾(5番目)に最も近い乳腺のセットの間の皮膚の外層のみをつかみ、手術用ハサミで小さな切開を行います。
- 閉じたハサミを切り口に導入し、先端をゆっくりと開いて、皮膚を下の腹壁膜から慎重に分離し、皮膚を無傷に保ちます。
- 腹部に垂直に切開し、皮膚を内膜から分離し続けます。第3乳腺と第4乳腺の間に、腹部を横切って水平に切り込みを入れ、皮膚の収縮と乳腺の視覚化を可能にします
手記：乳腺腫瘍と腺は、表面的には皮膚の下にあります。
- 各腫瘍または正常腺を鉗子でつかみ、手術用ハサミを使用して付着した皮膚を慎重にトリミングします。
- 切除した組織を組織使い捨てベース型に入れ、事前にラベル付けし、最適な切断温度(OCT)埋め込み媒体で満たし、ドライアイスの上に置いて型をすばやく凍結します。オフターゲット送達を研究するために、関心のある他の組織または臓器(肝臓や肺など)を切除します />
手記：この時点でプロトコールを一時停止するには、凍結ティッシュブロックを続行する準備ができるまで-80°Cで保存します。
- クライオスタットを使用して、凍結組織ブロックを厚さ10 μmで切片化し、隣接する切片を標識済みの接着スライドガラス上に配置します><。
手記：この時点でプロトコールを一時停止するには、続行する準備ができるまでスライドを-80°Cで保存します。
4. Ex vivo染色プロトコール
>注:蛍光顕微鏡画像間の定量的比較のために、すべてのスライドは同じ調製された溶液で同時に染色されます。
- 凍結ティッシュスライドを室温PBSで5分間すすぎ、OCTを除去します。
- 疎水性バリアペンで組織切片を画定し、染色中に必要な溶液の量を減らします.
手記：ペンが組織サンプルの上を走らないように注意してください スライドから組織を取り除くか、患部組織部分の適切な染色を妨げる可能性があります。組織切片がどの時点でも脱水しないようにしてください。
- 組織切片を4%パラホルムアルデヒド溶液で5分間固定します。
- スライドをPBSで5分間すすぎます。
- 0.5% Triton-X 100 in PBSで組織切片を15分間透過処理します。
- スライドをPBSで5分間すすぎます。
- 3% w/v ウシ血清アルブミン (BSA) と 5% v/v ヤギ血清で組織を PBS (ブロッキング溶液) 中で室温で 1 時間ブロックします。
手記：ブロッキング溶液の血清を二次抗体宿主動物に一致させます。
- スライドをPBSで5分間すすぎます。
- 必要に応じて、記録保持用の一次抗体(一般的な核抗体など)、血管マーカー(CD31など)、または細胞質マーカー(アクチンなど)を使用して切片をインキュベートします。ここでは、1:100の希釈でラット抗マウスCD31(血管マーカー)を、スライドトレイ上の脱水から保護されたブロッキング溶液で4°Cで一晩、製造元の指示に従って使用しました
手記：一次抗体や抗体標識を追加しないでください。注入され、in vivoで組織に蓄積されたコンジュゲートは、一次抗体として機能します。
- スライドをPBSで5分間3回すすぎ、毎回PBSを交換します。
- スライドを二次抗体とインキュベートして、一次抗体を標識します。このアプリケーションでは、AlexaFluor-546標識ヤギ抗ウサギ抗体(1:200希釈、メーカーの指示に従って最適化)およびCD31とAlexaFluor-488ヤギ抗ラット二次抗体(1:200希釈、メーカーの指示に従って最適化)を使用して、室温で1時間、光や脱水から保護されたブロッキング溶液中で抗B7-H3抗体を視覚化します
手記：二次抗体は同じ宿主動物由来ですが、二次抗体とそれぞれの一次抗体の宿主種との親和性が一致しています。この時点からスライドは光から保護されます。
- スライドをPBSで5分間3回すすぎ、毎回PBSを交換します。
- 封入剤をティッシュスライスの中央に1滴塗布し、気泡が溜まらないようにカバースリップを慎重に置きます。
- カバースリップの端を透明なマニキュアで密封し、乾かします.
手記：この時点でプロトコールを最大1週間一時停止するには、続行する準備ができるまでスライドを-20°Cで保存します。
>5. 共焦点顕微鏡イメージングと定量的画像解析
>注:共焦点顕微鏡とイメージングパラメータの準備は、使用する共焦点システムによって異なります。ここで使用した顕微鏡は市販のもの(例:Zeiss LSM 510 Metaシステム)を使用し、関連する取得ソフトウェア(例:Zen 2009)を使用しました。ただし、これらの手順の多くは、どの共焦点顕微鏡にも適用でき、基本的な共焦点顕微鏡の知識を前提としています。
- システムの電源を入れてウォームアップした後、目的の対物レンズを選択します。ここでは、20倍(開口数 = 0.8)の対物レンズを使用しました。
- ポジティブコントロールスライドをロードし、カバースリップを下にして、最も明るい信号の最適化を設定できるようにします。赤チャンネルでイメージングし、ライブイメージングモードでシステムをサンプルに焦点を合わせます。
- 使用するレーザーチャンネルごとに、レーザー強度、マスターゲイン、ピンホールサイズを次のように最適化します。
- イメージングのために連続モードに切り替えます。
- ルックアップテーブル(LUT)ヒストグラムを監視しながら、レーザー強度(レーザー出力を制御する)とゲイン(マスター)(光電子増倍管の電圧を制御する)スライドバーを最適化します。ヒストグラムのダイナミック レンジがピクセルを飽和させずに塗りつぶされるまで、これら 2 つの設定を調整します。
手記：レーザー強度が高すぎると、光退色が発生します。ゲイン(マスター)が高すぎると、画像にノイズが入ります。理想的には、ゲイン(マスター)はその範囲の中央にあります。
- ピンホールを1エアリーユニット(AU)に設定すると、最高の解像度と最も薄いzスライスが得られます。
- デジタル オフセット バーをスライドして、LUT ヒストグラムのノイズ フロアを最小限に抑え、真の黒の背景にします。
手記： 顕微鏡の設定が各レーザーチャンネルと対物レンズに最適化されたら、イメージングセッション全体およびすべてのスライドのイメージングでそれらを一定に保ち、スライド間の定量的な比較を可能にします。
- [Acquisition Mode] タブの [Averaging] で、目的の [Number] と [Bit Depth] を選択します。「最適」ボタンをクリックして、最適なピクセルサイズを設定します。
- スナップ取得ボタンを使用して、高品質の画像を収集します。ここでは、腫瘍内からランダムな視野が選択されましたが、他の関心領域は、異なるアプリケーション(血管、腫瘍の縁、浸透深さなど)に適用される場合があります
- 画像ファイルは、コンフォーカルソフトウェアが使用する形式(ここでは「.lsm」)で保存し、オフラインでの処理と定量化を行います。
手記：同じセッション中にすべてのスライドが画像化されない場合は、設定を保存し、次回の訪問時に再読み込みしますが、同じスライドの画像化は光退色のためにお勧めしません。
- 定量的な蛍光強度測定を行います。フィジーを開き(フィジーは単なるImageJソフトウェアです)、.lsmイメージファイルをステータスバーにドラッグしてロードします。
- カラーチャネルデータを分割します。「イメージ」>「スタック」に移動し、「チャンネルを分割」>。
- 必要に応じて蛍光画像を前処理する(つまり、バックグラウンドシグナルを減算する(Process > Subtract Background)か、フィルタリング法でノイズを低減します。
- シグナル強度に閾値を設定することにより、参照タンパク質(血管、核、細胞染色)に対応するカラーチャネルをセグメント化します(Image > Adjust > Threshold).
手記： 手動しきい値処理は、画像解析に主観性を導入するため、自動しきい値処理アルゴリズムを使用したり、画像ヒストグラムを参照したりすることで、画像解析結果の偏りが少なくなります。
- このしきい値を使用して、バイナリ マスクを作成します (Process > Binary > Convert to Mask)。
- マスク内の ROI を測定し、ラベルを付けます ([解析] > [粒子の分析] > [マネージャーに追加] > [OK] をオンにします)。
- 目的の抗体に対応するカラーチャネルにROIを適用します(チャネル画像をクリック、Analyze > Tools>ROI Manager > Measure)。これにより、マスクROIが抗体画像に適用され、結果ウィンドウでラベルセクションの画像測定値が提供されます。結果の保存ウィンドウ ([ファイル] > [保存])
- ここで説明するように、平均蛍光強度など、目的の統計量を計算します。
- スライドのセット内の各画像に対して、すべての処理手順を同じように実行します。大きな画像バッチに対してこれを自動的に行うマクロを作成します。
- 定量的な測定後にのみ画像を表示する場合は、定性的な画像調整を適用して、すべてのスライドで最小、最大、明るさ、コントラストを同じレベルに調整することにより、生体内分布パターンの視覚化を最適化します(Image > Adjust > Brightness/Contrast)。
- 画像の種類 (画像>種類 > RGB カラー) を変換し、プレゼンテーションや出版物で使用するために、.tiff (ファイル> 名前を付けて保存 > Tiff...) などの可逆画像形式でファイルを保存します。