唾液中の病原体特異的抗体を同定するためのビーズベースのマルチプレックス免疫測定法

Abstract

出典:Augustine, S. A. J., et al. 環境病原体へのヒト曝露を測定するための唾液抗体マルチプレックス免疫測定法の開発。 J. Vis. Exp. (2016年)。

このビデオは、ヒトの唾液中の複数の環境病原体に対する抗体を同時に検出するビーズベースのマルチプレックスイムノアッセイ技術を示しています。蛍光ビーズは、ヒト唾液サンプル中の抗体を用いて捕捉された異なる病原体由来の抗原に結合しました。蛍光レポーターを使用して抗体を標識した後、ビーズをフローサイトメトリーを使用して分析し、唾液中のさまざまな病原体特異的抗体の存在を評価しました。

Protocol

1. ビーズカップリング

1. 表1に示す濃度を用いて、抗原をビーズセットに結合します。
2. 活性化ビーズに各抗原を添加し、50 mM MES、pH 5.0で総容量を500 μlにします。抗原とビーズをボルテックスで混合します。
3. 抗原とビーズを室温で暗所で回転(~15rpm)して混合しながら2時間インキュベートします。結合ビーズを10,000 x gの微量遠心分離により2分間ペレット
化します。
4. 上清を取り除き、500 μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)-ウシ血清アルブミン(BSA)-ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート(Tween-20)-アジ化ナトリウム(PBS-TBN)pH 7.4にボルテックスおよび超音波処理によりビーズを再懸濁します。ビーズを10,000 x gの微量遠心分離により2分間ペレット化し、上清を除去します
   注意：アジ化ナトリウムは急性毒性のある化学物質です。飲み込んだり、皮膚に触れたりすると致命的です。ほこり/煙/ガス/ミスト/蒸気を吸い込んだり、スプレーしたりしないでください。適切な法律に従って取り扱いおよび廃棄する場合は、適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。
5. ビーズを1mlのPBS-TBNに再懸濁し、ボルテックスおよび超音波処理により20秒間行う。
6. ビーズを10,000 x gの微量遠心分離により2分間ペレット
化します。
7. 手順 1.5 と 1.6.
   を繰り返します 手記：これにより、PBS-TBNで合計2回の洗浄が可能になります。
8. 結合して洗浄したビーズを1 mLのPBS、1% BSA、0.05%アジド、pH 7.4に再懸濁します。結合したビーズは、暗所で2〜8°Cの冷蔵庫に保管します。

>2. 唾液マルチプレックス免疫測定法

1. -80°Cの冷凍庫から唾液を取り出し、室温で解凍します。
2. 抗原結合ビーズストックをボルテックスおよび超音波処理により20秒間再懸濁する。
3. 結合ビーズストックをPBS-1% BSAバッファーにセットした各ビーズの最終濃度100ビーズ/μlまで希釈することにより、ワーキングビーズ混合物を調製します。
4. PBS-1% BSAバッファーを用いて唾液を1:4に希釈し、96ウェルのディープウェルプレートに調製します。
5. フィルタープレートを100μlの洗浄バッファーで事前に湿らせ、上清を真空で除去します。
6. 50 μlのワーキングビーズ混合物と等量の希釈唾液を96ウェルフィルタープレートの95ウェルに加え、最終希釈を1:8にします。マルチチャンネルピペッターで反応を混合します。1つのコントロールウェルに、抗原結合ビーズ50 μLとPBS-1% BSAバッファー50 μl(唾液の代替品として)を加えます。
7. 蓋をして、暗所で室温で1時間、マイクロプレートシェーカーで500rpmでインキュベートします。上清を真空で取り除きます。100 μlの洗浄バッファーでウェルを洗浄し、上清を真空で除去します。1回洗濯を繰り返します。
8. マルチチャンネルピペッターでビーズをPBS-1% BSA50 μlに再懸濁します。
9. ビオチン化ヤギ抗ヒトIgG二次検出抗体をPBS-1% BSAで16 μg/mLに希釈します。
10. 希釈した50 μLの二次抗体を各ウェルに加え、マルチチャンネルピペッターで内容物を混合します。
11. フィルタープレートを覆い、プレートシェーカーで室温で30分間暗所でインキュベートします。上清を真空で取り除きます。100 μlの洗浄バッファーでウェルを洗浄し、上清を真空で除去します。1回洗濯を繰り返します。
12. マルチチャンネルピペッターでビーズをPBS-1% BSA50 μlに再懸濁します。
13. ストレプトアビジン-R-フィコエリトリンレポーター(SAPE)をPBS-1%BSAで24μg / mlに希釈します。.
14. 各ウェルに50 μlのレポーターを加え、マルチチャンネルピペットで混合します。
15. フィルタープレートを覆い、プレートシェーカーで室温で30分間暗所でインキュベートします。上清を真空で取り除きます。100 μlの洗浄バッファーでウェルを洗浄し、上清を真空で除去します。1回洗濯を繰り返します。
ビーズを
16. 100 μlのPBS-1% BSAに再懸濁し、分析装置を使用して50 μlを分析します><。 手記：マルチプレックスイムノアッセイの結果は、中央蛍光強度(MFI)単位で測定されます。エラーを避けるために、ソフトウェアマニュアルがある場合は、常に最新バージョンを参照してください。

>表1:マルチプレックスイムノアッセイ用のワーキングビーズミックス。カップリングと確認が完了した後、図のように各ビーズセットからなるマスターミックスを調製した。マスターミックスは、96ウェルプレートのすべてのウェルに分配されました。すべてのウェルは唾液でインキュベートされましたが、ビーズとPBS-1% BSAバッファーのみを含む1つのバックグラウンドコントロールウェルは

例外でした。 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 千株

抗原	ビーズセット	カップリングバッファ	銀濃度(μg)	1つのコーナーにビーズの#	# ビーズ数/μl	100 B/uL 4 ml 用容量 (μl)
C.ジェジュニ	8	MES 5.0	50	64	6,400	94
ピロリ	33	MES 5.0	25	71	7,100	85
A型肝炎	42	MES 5.0	100	91	¥9,100	66
T.ゴンディ	30	MES 5.0	25	85	8,500	71
ノロウイルスGII.4	55	MES 5.0	5	72	7,200	83
ノロウイルスGI.1	67	MES 5.0	5	63	6,300	95
結合解除	80	MES 5.0		60	6,000	100
		ビーズの総量(μl)				594
		必要なバッファの総量(μl)				3,406

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
機器とソフトウェア
マイクロ遠心分離機	サーモエレクトロン株式会社	75002446	サンプルの遠心分離に使用
ボルテックスミキサー	VWRの	G560	サンプルの混合に使用
ソニケーター(ミニ)	フィッシャーサイエンティフィック	15-337-22	ビーズの分離に使用
ピペッターP10、P20、P100、P1000、8チャンネル	キャップ	諸
マルチスクリーンバキュームマニホールド	ミリポア	MSVMHTS00	上澄みを落とすための洗浄工程で使用
マイクロシェイカー	VWRの	12620-926	インキュベーション中にビーズを攪拌するために使用されます
チューブラック(1.5mL・0.5mL)(アソート)	VWRの	30128-346
体重計	メトラーまたはその他		バッファーを作るための洗浄試薬の測定に使用
Dynabeadサンプルミキサー	インビトゲン	947から01	カップリングインキュベーションステップで使用
マットラボ (R2014b)	The MathWorks, Inc. (英語)		抗体応答データの解析に使用
マイクロソフトエクセル 2014	マイクロソフト株式会社		抗体応答データの解析に使用
Luminex Analyzer と xPonent 3.1 ソフトウェア	ルミネックスコーポレーション	LX200-XPON3.1	アッセイの実行に使用される機器およびソフトウェア
抗原
GI.1 ノーウォークウイルス : p粒子	Xi Jiang (CCHMC)*	NAの	*シンシナティ小児病院。最終濃度 5 μg。
GII.4 ノロウイルス VA387 : p粒子	Xi Jiang (CCHMC)*	NAの	*シンシナティ小児病院。最終濃度 5 μg。
A型肝炎ウイルス:細胞培養からのグレードII濃縮物	メリディアン・ライフサイエンス	8505	100 μgで結合した抗原
ヘリコバクター・ピロリ : ライセート	メリディアン・ライフサイエンス	R14101	25 μgで結合した抗原
トキソプラズマ原虫:組換え体p30(SAG1)	メリディアン・ライフサイエンス	R18426	25 μgで結合した抗原
Campylobacter jejuni : 熱によって全細胞が死滅	KPLの	50〜92〜93	50 μgで結合した抗原
一次抗体
モルモット抗ノロウイルス	(CCHMC)*	NAの	カップリング確認に使用
マウス抗A型肝炎IgG	メリディアン・ライフサイエンス	C65885M	カップリング確認に使用
マウス抗A型肝炎IgG	メリディアン・ライフサイエンス	C65885M	カップリング確認に使用
BacTraceAffinity 精製抗体、ヘリコバクター・ピロリ	KPLの	01-93-94	カップリング確認に使用
ヤギのpAbからトキソプラズマgondiiへ	アブカム	AB23507	カップリング確認に使用
BacTrace ヤギの抗カンピロバクター種	KPLの	01-92-93	カップリング確認に使用
二次抗体
ビオチン-SP-結合アフィニピュアロバ抗ヤギIgG(H + L)	ジャクソン	〒705-065-149	カップリング確認に使用
ビオチン化ウサギ抗ヤギIgG(H + L)	KPLの	16年13月06	カップリング確認に使用
ビオチン化ヤギ抗マウスIgG(H + L)	KPLの	16年18月06	カップリング確認に使用
アフィニティー精製抗体ビオチン標識ヤギ抗ウサギIgG(H + L)	KPLの	176-1506	カップリング確認に使用
アフィニティー精製抗体 ビオチン標識ヤギ抗ヒトIgG(γ)	KPLの	16年10月02	唾液イムノアッセイに使用
消耗 品
1.5 mL共重合体マイクロ遠心チューブ	USAサイエンティフィック	1415-2500	低結合性微量遠心チューブとして使用
10 μL ピペットチップリフィル	バイオベンチャーズ	5030050C
200 μL ピペットチップリフィル	バイオベンチャーズ	5030080C
1000 μL ピペットチップリフィル	バイオベンチャーズ	5130140C
アルミホイル	さまざまなベンダー		インキュベーション中にビーズを暗闇に保管するために使用されます
ディープウェルプレート	VWRの	〒40002-009	唾液サンプルの希釈に使用
マルチスクリーンフィルタープレート	ミリポア	MABVN1250	アッセイの実行に使用
オラコール唾液採取システム	マルバーン・メディカル・デベロップメント・リミテッド		唾液採取に使用
試薬
カルボキシル化ミクロスフェア(ビーズ)	ルミネックスコーポレーション	ビーズセットに依存	抗原はミクロスフェアに結合しています
EDC(1-エチル-3-[3ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩)	刺す	77149または22980	ビーズの活性化に使用
スルホ-NHS(N-ヒドロキシスルホスクシンイミド)	刺す	24510	ビーズの活性化に使用
ステプタビジン-R-フィコエリトリン(1mg / mL)	分子プローブ	S-866	レポーターとして起用
MES(2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸)	シグマ	M-2933	カップリングに使用
Tween-20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)	シグマ	P-9416	非特異的結合を除去するために洗浄バッファーで使用
タンパク質バッファー
PBS-TBN ブロッキング/保存バッファー (PBS、0.1% BSA、0.02% Tween-20、0.05% アジド、pH 7.4)**			フィルター滅菌し、4°Cで保存
PBS、pH 7.4	シグマ	P-3813	138 mM NaCl、2.7 mM KCl
BSAの	シグマ	A-7888	0.1% (w/v)
Tween-20 (トゥイーン 20	シグマ	P-9416	0.2% (v/v)
アジ化ナトリウム(0.05%アジ化物)**	シグマ	S-8032	**注意:アジ化ナトリウムは急性毒性があります。皮膚や目との接触を避けてください。適切なPPEを着用してください。適用される法律に従って廃棄してください。
MES/カップリングバッファー(0.05 M MES、pH 5.0)
MES(2-[N-モルホリノ]エタンスルホン酸)	シグマ	S-3139
5 N NaOH	漁夫	SS256-500
アッセイバッファー(PBS、1% BSA、pH 7.4)			フィルター滅菌し、4°Cで保存
PBS、1% BSA、pH 7.4	シグマ	P-3688	138 mM NaCl、2.7 mM KCl、1% BSA
活性化バッファー (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)			フィルター滅菌し、4°Cで保存
NaH2PO4(リン酸ナトリウム、一塩基性無水物)	シグマ	S-3139	0.1M NaH2PO4
5 N NaOH	漁夫	SS256-500
洗浄バッファー(PBS、0.05% Tween-20、pH 7.4)			フィルター滅菌し、4°Cで保存
PBS、0.05% Tween-20、pH 7.4	シグマ	P-3563	138 mM NaCl、2.7 mM KCl、0.05% TWEEN