ヒト食細胞による真菌性胞子食作用の定量的フローサイトメトリー測定

要約

出典:Hartung, S., et al., Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、ヒト白血球によるFITC標識病原性真菌胞子の食作用を定量化する方法を示しています。食作用した胞子は、対比染色によって細胞付着胞子から識別され、続いてフローサイトメトリー分析が行われます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 食作用アッセイ

1. 2 x 10⁶ 白血球と 4 x 10⁶ FITC 標識分生子 (感染の多重度 = 2) を 1.5 mL の RPMI + 10% FCS で 12 ウェル細胞培養プレートでインキュベートします。コントロールとして、細胞のみ(分生子なし)および細胞+標識されていない分生子を含めます。
2. 加湿した_CO2インキュベーターに37°Cで入れ、所望の時間(0.5時間、2時間、4時間など)インキュベー
トします。
3. インキュベーション後、セルスクレーパーで細胞を回収し、15mLのチューブに入れます。
4. 室温で300 x gで5分間遠心します。
5. サイトカイン分析のために上清を採取するか、不要な場合は廃棄してください。各サンプルを100 μLのPBS + 2 mM EDTAに再懸濁します。

2. 抗体染色

1. 各サンプルについて、表1に従って、APC抗FITC抗体を含む抗体ミックス100 μLを調製します。
2. 100 μLのサンプルを96ウェルV底プレートの1ウェルに入れます。150 μLのPBS + 2 mM EDTAを添加して洗浄します。
3. 色補正のために、各色ごとに1 x 10⁶セルを96ウェルV底板のさらにウェルに配置します。染色されていない細胞のウェルを含めます。150 μLのPBS + 2 mM EDTAを添加して洗浄します。
4. プレートを接着ホイルで覆います。
5. 室温で300 x gで5分間遠心します。ホイルを取り除きます。
6. シンクの上でプレートを一度だけすばやく力強く反転させるか、使い捨てのペーパータオルを使用して、上澄みを捨てます><。 注意: プレートから細胞が大量に失われるため、乾くまでプレートを紙の上に繰り返したりノックしたりしないでください。
7. 100 μL抗体ミックスに細胞を再懸濁し、ピペッティングでよく混合します。
8. 色補正のために、各細胞を100 μLのPBS + 2 mM EDTAに再懸濁し、抗体ミックスで使用したのと同じ量の抗体を各ウェルに1つ追加します。
9. 接着ホイルで覆い、暗所で室温で20分間インキュベートします。
10. ホイルを取り除きます。150 μLのPBS + 2 mM EDTAを各ウェルに加えて洗浄します。粘着ホイルで覆います。
11. 室温で300 x gで5分間遠心します。ホイルを取り除きます。シンクまたは使い捨てのペーパータオルの上でプレートをすばやく強力に反転させて、上澄みを捨てます。
12. 200 μL の PBS + 2 mM EDTA に再懸濁し、各ウェルから細胞を別々の丸底チューブに移します。懸濁液に細胞クラスターがないことを確認してください。それ以外の場合はクラスターを削除します。.
    注:目で見るのに十分な大きさのクラスターはすべて、サイトメーターを詰まらせる可能性のある大きさです。

>3. フローサイトメトリー

1. フローサイトメーターを始動し、ウォームアップします。取得ソフトウェアを起動します。
2. 新しい実験を作成し、サンプルを設定してラベル付けします。
3. 蛍光色素FITC、APC、BUV395、V500、PerCP-Cy5.5のパラメータ(FSC 250、SSC 250)と検出器を設定します。
4. 報酬の設定
   1. 報酬設定を開きます。
   2. 個々の色を示します。
   3. 未染色のまま、または個々の染色をしたコントロールセルを使用して、スケール内のすべてのイベントが含まれるようにPMT検出器の電圧を設定します。
   4. 各コントロールの少なくとも 10,000 個のイベントを記録します。
   5. コンペンセーションセットアップを使用して、蛍光色素のスピルオーバーを計算し、実験のサイトメーター設定に適用します。
5. サンプルデータの記録
   1. FSCとSSCを取得ソフトウェアに表示し、白血球の周囲にゲートを設定します。
   2. 白血球ゲートを基に、分生子から分離するCD45⁺細胞のSSC/CD45とゲートをドットプロットで表示します。
   3. CD45⁺細胞をドットプロットでCD14/CD66bに表示し、ゲート単球(CD14⁺)と好中球(CD66b⁺)を別々に表示します。
   4. 好中球をドットプロットの反FITC/FITCで表示します。
   5. 標識されていない分生子を含むサンプルを使用して、抗FITCおよびFITCシグナルの象限を設定し、それぞれの象限に最大1%の細胞を許容します。
   6. 単球ゲートについて、手順3.5.4と3.5.5を繰り返します。
   7. 白血球ゲートに少なくとも 20,000 のイベントを含むすべてのサンプルを記録します。

表1:フローサイトメトリー用の抗体ミックス。各試薬の量は、分析するサンプル(1 x 10⁶細胞)あたりのマイクロリットルとして与えられます。

名 名

試薬	μl/サンプル
CD45 BUV395	1
CD14 V500	0.5
CD66b PerCP-Cy5.5	1.5
アンチFITCのAPC	0.5
PBS + 2 mM EDTA	97
トータル	100

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
接着箔	ブランド	701367
細胞培養プレート、12ウェル	グライナーバイオワン	665180
サイトメーター	BDバイオサイエンス		LSR Fortessa II、レーザー:488 nm(青)、405 nm(紫)、355 nm(UV)、640 nm(赤)
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマ・アルドリッチ	ED3SS-500グラム	PBSで2 mM
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)	シグマ・アルドリッチ	F3651-100MG	0.1 mM の Na2CO3 /PBS 溶液
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	189012から014	カルシウムなし、マグネシウムなし
RPMIの1640	サーモフィッシャーサイエンティフィック	61870010	RPMI 1640 ミディアム、GlutaMAX サプリメント
データ集録および解析用ソフトウェア	BDバイオサイエンス
Vボトムプレート、96ウェル	ブランド	781601	未処理の表面
ホルムアルデヒド	カール・ロス	PO87.3	ヒストフィックス

シリーズ