ヒト食細胞による真菌性胞子食作用の定量的フローサイトメトリー測定

要約

出典:Hartung, S., et al., Measuring Phagocytosis of Aspergillus fumigatus Conidia by Human Leukocytes using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、ヒト白血球によるFITC標識病原性真菌胞子の食作用を定量化する方法を示しています。食作用した胞子は、対比染色によって細胞付着胞子から識別され、続いてフローサイトメトリー分析が行われます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 食作用アッセイ

1. 2 x 10⁶ 白血球と 4 x 10⁶ FITC 標識分生子 (感染の多重度 = 2) を 1.5 mL の RPMI + 10% FCS で 12 ウェル細胞培養プレートでインキュベートします。コントロールとして、細胞のみ(分生子なし)および細胞+標識されていない分生子を含めます。
2. 加湿した_CO2インキュベーターに37°Cで入れ、所望の時間(0.5時間、2時間、4時間など)インキュベー
トします。
3. インキュベーション後、セルスクレーパーで細胞を回収し、15mLのチューブに入れます。
4. 室温で300 x gで5分間遠心します。
5. サイトカイン分析のために上清を採取するか、不要な場合は廃棄してください。各サンプルを100 μLのPBS + 2 mM EDTAに再懸濁します。

2. 抗体染色

1. 各サンプルについて、表1に従って、APC抗FITC抗体を含む抗体ミックス100 μLを調製します。
....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
接着箔	ブランド	701367
細胞培養プレート、12ウェル	グライナーバイオワン	665180
サイトメーター	BDバイオサイエンス		LSR Fortessa II、レーザー:488 nm(青)、405 nm(紫)、355 nm(UV)、640 nm(赤)
エチレンジアミン四酢酸(EDTA)	シグマ・アルドリッチ	ED3SS-500グラム	PBSで2 mM
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)	シグマ・アルドリッチ	F3651-100MG	0.1 mM の Na2CO3 /PBS 溶液
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	189012から014	カルシウムなし、マグネシウムなし
RPMIの1640	サーモフィッシャーサイエンティフィック	61870010	RPMI 1640 ミディアム、GlutaMAX サプリメント
データ集録および解析用ソフトウェア	BDバイオサイエンス
Vボトムプレート、96ウェル	ブランド	781601	未処理の表面
ホルムアルデヒド	カール・ロス	PO87.3	ヒストフィックス

シリーズ