哺乳類のストレス顆粒の特性評価と定量のための免疫蛍光アッセイ

要約

出典:Aulas, A. et al., 細胞質病巣を哺乳類ストレス顆粒として分類する方法。J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオでは、mRNA、RNA結合タンパク質(RBP)、およびその他のさまざまなタンパク質で構成される哺乳類のストレス顆粒の特性評価と定量化のためのアッセイを示しています。

プロトコル

1. 細胞の準備

1. 図1Aに示すように、24ウェルプレートの12ウェルにオートクレーブ処理したカバースリップを添加します。これは、真空装置に取り付けられた滅菌パスツールピペットを使用して各カバースリップをピックアップするために行うことができます。ウェルの側面にあるカバースリップを軽くたたいて吸引を解放し、カバースリップをウェルに落下させます。
2. プレート 1 x 10⁵ U-2 OS (U2OS) 骨肉腫細胞 1 ウェルあたり 500 μL の培地で。プレートを左右に、上下に数回動かして、セルが均等に分布していることを確認します。
3. 清潔なP1000チップでカバースリップをそっと押し下げて、カバースリップがウェルの底にあり、カバースリップの下に気泡がないことを確認します。

2. 細胞にストレスを与える

1. 翌日、プレートを目視で確認し、サンプル間のばらつきが結果の再現性に悪影響を与える可能性があるため、細胞がカバーガラス全体に均一に分散し、均一に合流していることを確認します。倒立組織培養顕微鏡で10倍対物レンズを使用します。
2. 培地を37°Cに予熱します。細胞に冷たい培地や高温の培地を塗布することは、それぞれコールドショックまたはヒートショックを引き起こすため、避けてください。
3. 予熱した媒体で薬物を希釈します。異なる薬物濃度ごとに、500 μLの培地を含む2つのウェルを調製します。ピペッティング中の損失を考慮して、さらに500 μLを準備します。4本のチューブを分注し、それぞれに1.5mLが含まれています。
   1. 亜ヒ酸ナトリウムの場合:500 μLを含む各ウェルに、100 mM亜ヒ酸ナトリウム(最終濃度:100 μM)を1.5 μL加えるか、100 mM亜ヒ酸ナトリウム(最終濃度:50 μM)を0.75 μL加えます。
   2. ビノレルビンの場合:500 μLを含む各ウェルに、22.5 μLの10 mMビノレルビン(最終濃度:150 μM)を添加するか、18.75 μLの10 mMビノレルビン(最終濃度:100 μM)を添加します。< br /> 手記：亜ヒ酸ナトリウムは、十分に特徴付けられ、一般的に使用される応力顆粒誘導剤であるため、ポジティブコントロールとして古典的に使用されています。
4. ウェルB1-4およびC1-4からメディアを取り出して廃棄します。薬剤を含むメディアを追加し、60分間待ちます(図1A)。
   1. 100 μM亜ヒ酸ナトリウムを含む500 μLの培地をウェルB1およびB2に加えます。500 μLの培地と50 μM亜ヒ酸ナトリウムをウェルB3およびB4に加えます。
   2. 150 μMビノレルビンを含む500 μLの培地をウェルC1およびC2に加えます。ウェルC3およびC4に500μLの培地と125μMビノレルビンを加えます。
5. 固定の30分前に、カラム2のウェルを5 μLのシクロヘキシミド(1 mg/mLストック)で処理し、カラム4のウェルを2 μLのピューロマイシン(1.25 mg/mLストック)で処理します。プレートを静かに揺らして混ぜ合わせてから、プレートを37°Cのインキュベーターに戻します。

3. 細胞固定と免疫蛍光

>注:実験の前に、メタノールが-20°Cに冷却されていることを確認し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、PBS中の5%正常馬血清(NHS)、PBS中の4%パラホルムアルデヒド(PFA)などの緩衝液を作製してください。

1. メディアを廃棄し、カバースリップを含むウェルをPBSで洗浄します。使用する薬物によっては、培地を含む薬物を適切に廃棄することが重要になる場合があります。具体的な手順については、地域の環境安全事務所にお問い合わせください。効率的に洗浄するには、スクイーズボトルにPBSを充填し、タイトな流れではなく穏やかな流れを可能にするために先端を切り取り、元のPBSを吸引した後、これを使用して各ウェルにPBSを追加します。
2. 4% PFA を ~250 μL の 4% PFA を室温で 15 分間使用して細胞を固定し、穏やかに撹拌しながら RT します。カバースリップの上部をPFAで完全に覆います。250μLで十分ですが、そうでない場合はさらに追加してください。一部の細胞(または細胞のストレス処理)は付着を変化させる可能性があり、ピペッティングによる力によって細胞が剥がれる可能性があるため、カバースリップに直接ピペッティングすることは常に避けてください。
3. PFAを取り外し、適切に廃棄します。パラホルムアルデヒドの適切な廃棄方法の詳細については、最寄りの環境安全事務所にお問い合わせください。
4. ~250 μL のメタノール (-20 °C) を加え、穏やかに振盪しながら RT で 5 分間インキュベートします。これにより、細胞が透過化され、平坦化されます。
5. メタノールを取り出して廃棄し、5% NHSを~250 μLの5% NHSを1時間、RTで一晩、O / N、4°Cで適用して細胞をブロックします。
6. 一次抗体については、抗体を5% NHS.
   で希釈します。 手記：複数のSGマーカーを使用することは、観察された顆粒が真正なSGであるかどうかを確認するための鍵となります。使用できるSGマーカーの数は、顕微鏡で使用可能なフィルターによって異なります。標準のグリーン、レッド、および遠赤のフィルターセットが利用可能な場合は、G3BP1、eIF4G、およびeIF3bを1/250希釈で使用します。
   1. この実験(カバースリップ12枚、各250 μL、合計:5% NHS3 mL)では、抗G3BP1、抗eIF3b、および抗eIF4Gをそれぞれ12 μL加えます。一次抗体を穏やかに撹拌し、室温またはO/Nで4°Cで少なくとも1時間インキュベー
   トします。
7. ウェルをPBSで3回洗浄し、各洗浄を5分間インキュベートします。
8. 二次抗体については、すべての二次抗体(1/250希釈)とHoechst色素(1/1,000希釈)を5% NHSで希釈します。
   1. この実験(カバースリップ12枚、各250 μL-合計:5% NHS3 mL)では、Cy2-Mouse、Cy3-Rabbit、Cy5-Goat(それぞれ1/250希釈)をそれぞれ12 μL加え、Hoechst色素3 μLを加えます。
   2. カバーガラスを二次抗体と室温で1時間インキュベートします。このステップと次のステップでは、プレートを箱で覆うか、組織培養皿の上にホイルを置いて、サンプルを光から保護します。
9. ウェルをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
10. 封入剤を使用して、ラベル付きのスライドガラスにカバースリップを取り付けます。封入剤を37°Cのヒートブロックで10分間加熱します。これにより粘度が下がり、ピペットがしやすくなります。P200チップをカットして、カバースリップごとに25μLの封入剤をスライドガラスにピペットで移します。4〜8枚のカバースリップを1枚のスライドガラスに収めることができますが、これは顕微鏡ステージでこれが可能であると仮定します。細い鉗子を使用して、カバースリップをウェルからスライドに移し、セル側を下にして封入剤の上に置きます。清潔なP200チップを使用して、カバースリップを押し下げます。
11. すべてのカバースリップを埋込したら、折りたたんだラボティッシュを使用して、ラボティッシュをスライドにしっかりと押し付けて余分な封入剤をクリーンアップします。H₂Oを含むスクイーズボトルを使用して余分な封入剤を洗い流し、折りたたんだラボティッシュでブロッティングを繰り返して水分を取り除きます。

結果

図1:実験図(A)示されているように、以前に24ウェルプレートに配置したカバースリップ上のシードセル。A列とB列をSAまたはVRBで60分間、示されている濃度(μM)で処理します。60分後、CHX(最終濃度:カラム2で20 μg/mL)またはピューロ(カラム4で20 μg/mLピューロマイシン)を薬剤含有培地に加えます。さらに30分間インキュベーションを続けてから、固定および染色します。(B)カウントのために画像化する必要があるフィールドを示すカバースリップの図。カバーガラスは、ほぼ等しい5つの領域に分割されています。各地域で1枚の画像が撮影されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
U-2 OS	ATCCの	ATCC®HTB-96™	- 一般的には「U2OS」と表記されます - 37°Cで5%CO2、10%FBS/DMEMで培養
ダルベッコによるイーグルズミディアムの改造	コーニング	10-013-履歴書	- 略称 DMEM - グルコース、ピルビン酸、フェノールレッド 4.5g/Lを配合 - 10% FBS、10 mM HEPES、およびペニシリン/ステプトマイシン を補充 - プレウォーミング先行薬 希釈 - プレウォーム以前の薬剤の希釈
ウシ胎児血清	シグマ	F2442-500ミリリットル	- 略称 FBS - メディアの補足に使用
HEPESの(1メートル)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630から080	- メディアの補足に使用
ペニシリンストレプトマイシン	シグマ	P0781-100ミリリットル	- メディアの補足に使用
24ウェルプレート	共演者	3524
実験用ティッシュ	キムテックサイエンス	34120	- 通称「キムワイプ」
成長カバーガラス用カバーガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-82	- 使用前にオートクレーブ滅菌済み - 組織培養フード内で滅菌してください
亜ヒ酸ナトリウム ≥90%	シグマ	S7400-100G	- 一般に亜ヒ酸ナトリウムと呼ばれ、SA と略されます - 1 M濃度で水に溶解し、その後、ワーキングストックとして100 μMに希釈します。
ビノレルビン	TSZケム	RS055	- 略称 VRB - 水に10 mMまで溶解
ピューロマイシン	シグマ	P9620	- 翻訳レベル(リボプロミスチル化)の評価に使用 - アクティブなtranslation とのSG接続を評価するために使用されます - 水で10 mg / mLに希釈します
エメチン二塩酸塩水和物	シグマ	E2375	- PUROと組み合わせて使用 し、一般的な翻訳レベル を評価する - アクティブなtranslation とのSG接続を評価するために使用されます - 水で10 mg / mLに希釈します
シクロヘキシミド	シグマ	C4859	- 略称 CHX - アクティブなtranslation とのSG接続を評価するために使用されます - 水で10 mg / mLに希釈します
リン酸緩衝生理食塩水	ロンザ / VWR	95042-486	- PBS と略されます - 免疫蛍光用の洗浄バッファー
パラホルムアルデヒド試薬グレード、結晶性	シグマ	P6148-500Gの	- ヒュームフード内の高温PBSに4%溶液を作り、溶解するまで攪拌します - アリコートは-20°Cで数ヶ月間保存できます - 危険な場合は、換気 を使用してください - 特殊廃棄物として廃棄する
メタノール、ACS	BDH / VWRの	BDH1135-4LP	- 使用前に-20°Cに予冷してください - 特殊廃棄物として廃棄する
ノーマルホースセラム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31874	- 略称 NHS - PBS で5%に希釈します - アジ化ナトリウムを加えて4°C で保存します - 免疫蛍光染色のためのブロッキング溶液
エタノール、ピュア、200プルーフ(100%)、USP、KOPTEC	デコンラボ / VWR	89125から188	- 水で70%に希釈します
Fisherbrand Superfrost Plus 顕微鏡スライド	フィッシャーブランド	12-550-15
マウス抗 G3BP1 抗体 (TT-Y)	サンタクルス	SC-81940	- 4°C で保存してください - 1/100希釈で使用
ウサギ抗eIF4G抗体 (H-300)	サンタクルス	SC-11373	- 4°C で保存してください - 1/250
ヤギ抗eIF3η(N-20)抗体	サンタクルス	SC-16377	- eIF3ηはeIF3b とも呼ばれます - 4°C で保存 - 1/250
Cy2 AffiniPure Donkey抗マウスIgG(H + L)	ジャクソン免疫研究	715-225-150	- 製造元の指示に従って水に再構成し、4°C で保存します - 1/250
Cy3 AffiniPure Donkey 抗ウサギIgG(H + L)	ジャクソン免疫研究	〒711-165-152	- 製造元の指示に従って水に再構成し、4°C で保存します - 1/2500希釈
Cy5 Affiniピュアドンキー抗ヤギIgG(H + L)	ジャクソン免疫研究	705-175-147	- 製造元の指示に従って水に再構成し、4°C で保存します - 1/250
Hoechst 33258ソリューション	シグマ	94403-1ミリリットル	- 二次抗体とインキュベートします-dH20に0.5 mg / mLのストック溶液、光から保護します-4°Cで保存
20 x SSCバッファ	サーモフィッシャー アンビオン	AM9763	- RNase Free water (DEPC 処理済み) を使用して 2X SSC に希釈します - 室温で保存します - FISH の洗浄バッファー
スライド埋込用紙	自家製	/	- PBSの20ミリリットルに5gの「冷溶性」ポリ(ビニルアルコール)を混合し、超音波処理により混合し、続いてRTで一晩攪拌し、5ミリリットルのグリセロールと0.2ミリリットルの20%アジ化ナトリウムを加え、RTで16時間攪拌する-20,000gで20分間、大きなペレットを廃棄する-粘性液体、 -20°Cで長期保存、4°Cで1週間
パラフィルム「M」	シグマ	P7793-1EA	- 通常「パラフィルム」と呼ばれます
ポリ(ビニルアルコール)	シグマ	品番:P-8136-250G	- ビノールを作るための試薬
グリセロール	シグマ	G5516-100ミリリットル	- ビノールを作るための試薬
アジ化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S2002-5Gの	- ブロッキング液およびビノール 用防腐剤 - 水で20%希釈します

名 します。 型 。 。 。 希釈 希釈 希釈 希釈 します シリーズ