顆粒球および単球における食作用および酸化的バースト活性を評価するためのアッセイ

要約

出典: Meaney, M. P. et al., Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、フローサイトメトリーを介してヒトの血液中の細胞による食作用活性を確認するアッセイを示しています。顆粒球と単球は、それぞれ飲み込まれた細菌の存在と酸化バースト活性を確認する緑と赤の蛍光を示すことにより、食作用を確認します。

プロトコル

人間の福祉に関する制度的、国内的、国際的なガイドラインに準拠して実施され、地元の施設審査委員会によって審査されています。

1. アッセイの準備

1. 手続きに指定された資料を収集、準備、整理します(特定の材料・機器の表を参照してください)。
   1. 12 x 75 mmチューブにラベルを付けます。
      1. 各参加者に 2 本のチューブをラベル付けします: 食作用アッセイ用の 1 本のチューブ (このチューブを黒インクでラベル付けし、フルオレセイン イソチオシアネート [FITC] の「F」でラベル付けします) と酸化バースト (OB) 活性アッセイ用の 1 本のチューブ (このチューブを赤インクでラベル付けし、ジヒドロエチジウム [HE] の「H」でラベル付けします)
         手記：意図しない細胞の活性化とそれに伴うバックグラウンドノイズの増加を最小限に抑えるために、滅菌済みの12 x 75 mmチューブの使用が推奨されます。
      2. アッセイコントロール用に3つのチューブをラベル付けします:食作用アッセイ用のチューブ1本(FITCコントロール:このチューブを黒インクと「F」でラベル付け)、OB活性アッセイ用のチューブ1本(HEコントロール:このチューブを赤インクと「H」でラベル付け)、ネガティブコントロール用のチューブ1本(血液のみ:このチューブに緑色のインクと「血液のみ」でラベル付け)します。
   2. アッセイ日の少なくとも1日前にストック溶液を調製してください。
      1. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を準備します。10x PBS100 mlを900 mlの18.2 MΩ H₂Oで希釈し、0.2 μmフィルターで滅菌します。使用するまで4°Cで保管してください。
      2. 滅菌PBSグルコースを準備します。1.0gのグルコースを100mlのPBSに溶解します。0.2μmのフィルターでフィルター滅菌します。使用するまで4°Cで保管してください。
      3. 滅菌済みの0.1 Mクエン酸緩衝液を調製します。1.2 gのクエン酸と1.1 gのクエン酸ナトリウムを100 mlの18.2 MΩ H₂Oに溶解し、pHを4.0に調整します。0.2μmのフィルターでフィルター滅菌します。使用するまで4°Cで保管してください。
      4. HEストック溶液を調製します。1.0 mgのHEを1.0 mlのジメチルスルホキシド(DMSO)に再懸濁します。穏やかに混合し、分注し、使用するまで-20°Cで保存します。
      5. FITC標識黄色ブドウ球菌(黄色ブドウ球菌)原液(2 x 10⁹粒子/ ml)を調製します。FITC標識黄色ブドウ球菌10 mgをPBS1.5 ml(または適切な量)に再懸濁します。.500μlのアリコートを3つに分け、メーカーの推奨に従って超音波処理します。アリコートし、使用するまで-20°Cで保存します。
      6. 標識されていない黄色ブドウ球菌ストック溶液(2 x 10⁹粒子/ ml)を調製します。100 mgの非標識黄色ブドウ球菌を15 ml(または適切な量)のPBSに再懸濁します。.500μlのアリコート30個に分け、メーカーの推奨に従って超音波処理します。アリコートし、使用するまで-20°Cで保存します。
   3. アッセイ当日に新鮮な作業溶液を調製します。
      1. HEワーキングソリューションを準備します。解凍したHEストック溶液10 μlをPBS-グルコース990 μlに移します。光から保護し、使用するまで氷の上に置いてください。
      2. FITC標識黄色ブドウ球菌ワーキング溶液(133,333粒子/μl)を調製します。解凍したFITC標識黄色ブドウ球菌ストック溶液70 μlをPBS980 μlに移します。光から保護し、使用するまで氷の上に置いてください。
      3. 非標識黄色ブドウ球菌の作業溶液(133,333粒子/μl)を調製します。解凍した非標識黄色ブドウ球菌ストック溶液70 μlをPBS980 μlに移します。光から保護し、使用するまで氷の上に置いてください。
      4. クエンチ溶液を準備します。0.4%トリパンブルー溶液750 μLを滅菌済み0.1 Mクエン酸緩衝液11.25 mLに加えます。使用するまで氷水浴に保管してください。
   4. 認定された瀉血医に、世界保健機関の採血ガイドラインに従って採血してもらいます。
      1. ジカリウムエチレンジアミン四酢酸(K₂EDTA)を含む1本の4ml採血チューブに血液を採取します。製造元の指示に従って採血管を反転させます。採血チューブは、使用するまでベンチトップロッカーで室温に保ちます。この血液は、ステップ1.2.1で説明した全血球計算(CBC)と白血球(WBC)の鑑別分析に使用します。
      2. ヘパリンリチウムを含む4mlの採血チューブ1本に血液を採取します。製造元の指示に従って採血管を反転させます。採血チューブは、使用するまでベンチトップロッカーで室温(RT)に保ちます。この血液は、ステップ2で説明した単球および顆粒球の食作用およびOB活性アッセイに使用します。
2. 各サンプルのアッセイを完了するために必要な細菌(すなわち、黄色ブドウ球菌)の量を決定します。
   1. 血液分析装置を使用して、製造元の指示に記載されているように、血液のWBC鑑別分析でCBCを実行します。WBCカウント(細胞/ ml)、好中球、および単球の%の値をメモします。
   2. 以下の式を使用して、各サンプルの好中球数と単球数を決定します。
      好中球数 (細胞数/ml) = 好中球× WBC (細胞数/ml)
      単球数(細胞数/ ml)= %単球×白血球(細胞/ ml)
   3. 以下の式を使用して、各サンプルの食細胞数と、サンプルの100 μlに存在する食細胞の数を決定します。
      食細胞数(細胞数/ ml)=好中球数(細胞数/ ml)+単球数(細胞/ ml)
      100 μl 中の食細胞数 = (食細胞数 (細胞数/mL))/10
   4. 以下の式を使用して、各サンプルに必要な細菌(すなわち、黄色ブドウ球菌)の数と、各チューブに添加すべきFITC標識黄色ブドウ球菌または非標識黄色ブドウ球菌の作業溶液(133,333粒子/ml)の量を決定します。
      手記：対象菌:食細胞の比率は8:1.
      必要な細菌の数 = 100 μl 中の食細胞の数 × 8
      必要なFITCまたは標識されていない作業溶液の量(μl)=(必要な細菌の数)/(133,333粒子/μl)

2. アッセイの実行

1. アッセイのために全血を調製します。
   1. 各参加者とコントロールチューブについて、延長ピペットチップを使用して、ヘパリン採取チューブのリチウムから100 μlの全血を、適切にラベル付けされた12 x 75 mmチューブの底に移します。caps.
      を交換してください 手記：12 x 75 mmチューブの側面に血液が付着しないように注意してください。
   2. マイクロピペットを使用して、赤インクと「H」でラベル付けされたチューブ(HEコントロールチューブを含む)に10 μlのHEワーキング溶液を加えます。キャップとボルテックスを短時間交換します。
   3. すべてのチューブを37°Cの水浴で15分間インキュベートします。その後、すぐにすべてのチューブを氷水浴に12分間移します><。 手記：オープンメタルラックを使用し、5分ごとにラックを静かに振って、チューブが迅速かつ適切に温められるか冷えていることを確認します。
2. 細菌(すなわち、黄色ブドウ球菌)をサンプルおよびコントロールチューブに加えます。
   1. マイクロピペットを使用して、適切な量(ステップ1.2.4で計算)の非標識黄色ブドウ球菌の作業溶液を、赤色インクと「H」でラベル付けされたチューブ(HEコントロールチューブを含む)に加えます。キャップとボルテックスを短時間交換します。
   2. マイクロピペットを使用して、FITCで標識された黄色ブドウ球菌の適切な量(ステップ1.2.4で計算)を、黒インクと「F」でラベル付けされたチューブ(FITCコントロールチューブを含む)に加えます。キャップとボルテックスを短時間交換します。
   3. 「血液のみ」のコントロールチューブをボルテックスしますが、どちらのタイプの細菌(つまり、黄色ブドウ球菌)も追加しないでください。
   4. すべてのチューブを37°Cのウォーターバスで20分間インキュベートし、オープンメタルラックを使用し、5分ごとにラックを静かに振って、チューブが迅速かつ適切に温まるようにします。インキュベーション期間後、直ちにすべてのチューブを氷水浴に1分間移します。
3. 細胞を洗浄します。
   1. リピーターピペットを使用して、100 μlの氷冷クエンチ溶液をすべてのチューブに加えます。キャップを元に戻し、短時間ボルテックスした後、すべてのチューブを氷上で1分間インキュベートします。
   2. リピーターピペットを使用して、氷冷したPBS1 mlをすべてのチューブに加えます。短時間ボルテックスしてから、氷のように冷えたPBSをさらに2 mlすべてのチューブに追加し、キャップを交換します。すべてのチューブを4°Cおよび270 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
   3. 手順2.3.2を1回繰り返します(合計2回の洗浄)。
4. フローサイトメトリー用のサンプルを調製します。
   1. リピーターピペットを使用して、氷冷したウシ胎児血清50 μlをすべてのチューブに加えます。すべてのチューブを一時的にボルテックスします。
   2. すべてのチューブを適切なカルーセルに移し、赤血球(RBC)溶解試薬とWBC固定試薬を備えた自動細胞溶解調製ワークステーションを使用して、製造元の指示に従ってRBCを溶解し、WBCを固定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12 x 75 mmチューブ、キャップ付き	VWRの	20170年579	サンプルあたり2本のチューブ(「H」と「F」)とバッチごとに3本のチューブが必要です(アッセイコントロール用、「F」、「H」、および「血液のみ」)。
PBS(10倍)、pH 7.4	ライフテクノロジー	〒70011-044
ボトルトップ 0.2μm 酢酸セルロースフィルター (容量500ml)	フィッシャーサイエンティフィック	09-741-07
グルコース、粉末	ライフテクノロジー	15023-021
クエン酸(無水、細胞培養試験、植物細胞培養試験)	シグマ・アルドリッチ	C2404-100G
クエン酸ナトリウム三塩基性二水和物	シグマ・アルドリッチ	S4641-25G
ジヒドロエチジウム(ヒドロエチジン)(HE)	ライフテクノロジー	D11347
ジメチルスルホキシド(DMSO)無水物	ライフテクノロジー	D12345
黄色ブドウ球菌(タンパク質Aを含まない木材株)BioParticles、フルオレセインコンジュゲート(FITC)	ライフテクノロジー	S2851
黄色ブドウ球菌(プロテインAを含まない木材株)BioParticles、標識なし	ライフテクノロジー	S-2859
トリパンブルー溶液、0.4%	ライフテクノロジー	15250-061
4.0 mL バキュテイナー、7.2 mg K2EDTA、噴霧乾燥	VWRの	BD367861	サンプルごとに1本のK2 EDTA採血管が必要です。
4.0 mL バキュテイナー (68 USP ユニットのリチウム ヘパリンを含む)、スプレーコーティング	VWRの	BD367884	サンプルごとに1本のリチウムヘパリン採血管が必要になります。
コールター AC・T 5デフ CP	ベックマン・コールター	6605705	すなわち、血液分析装置
コールター AC・T 5デフリンス	ベックマン・コールター	8547167
コールター AC・T 5デフフィックス	ベックマン・コールター	8547171
コールター AC・T 5diff WBC ライス	ベックマン・コールター	8547170
コールター AC・T 5diff Hgb Lyse	ベックマン・コールター	8547168
コールター Ac・T 5diff Cal キャリブレーター	ベックマン・コールター	7547175
コールター AC・T 5デフ コントロールプラス	ベックマン・コールター	7547198
AcT 5diff 希釈液	ベックマン・コールター	8547169
200 μL 延長ピペットチップ	VWRの	37001-526
断熱アイスパン	VWRの	89198-980	氷水浴用。
オープンメタルチューブラック	VWRの	〒60916-702
ウシ胎児血清	ライフテクノロジー	26140-111
TQ-Prepワークステーション	ベックマン・コールター	6605429	すなわち、自動細胞溶解調製ワークステーション
ImmunoPrep試薬システム	ベックマン・コールター	7546999	すなわち、RBCリセ/WBC固定試薬システム
コールター・クレンツ	ベックマン・コールター	8546929

月