ヒト粘膜内層液中の免疫メディエーターレベルの定量化

要約

出典:Wolsk, H. M. et al., In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levelsの定量化のための粘膜内層液の非侵襲的サンプリング。J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオは、新生児のヒト鼻粘膜内層液抽出物中の免疫メディエーターレベルの定量化を示しています。電気化学発光ベースのマルチプレックスアッセイシステムは、これらのメディエーターが励起されたときに放出される光の強度を評価することにより、これらのメディエーターを測定します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>1. 実験的な設定

1. 濾紙(繊維状水酸化ポリエステルシート、材料表参照)のシートを使用してください。
   1. 生後1ヶ月の子供には3 x 15 mmのサイズに、それ以上の子供と大人にはL字型(5 x 20 x 10 mm(Lの短いアーム))に切り抜きます。
2. 鉗子を使用して、乳児の各鼻孔に濾紙を1枚挿入します。下鼻甲介の前部(新生児の場合は鼻孔の内側約1 cm、他のすべての年齢の場合は1.5 cm)に濾紙を置きます。
   1. 新生児をベッドに寝かせ、快適さのために砂糖水を与えます
      手記：他のすべての年齢の子供の場合、サンプリングは被験者を椅子に座らせた状態で最も簡単に実行できます。
   2. 年長のお子様の場合は、L字型濾紙の長いアームを各鼻孔に挿入します。
3. 鼻孔の周りにノーズクリップを取り付けて、不快感を最小限に抑え、濾紙を誤って紛失しないようにします。
4. 吸収から2分後に濾紙をはがします。
5. 濾紙をラベル付きのチューブに入れ、すぐに-80°Cで凍結します。
6. サンプリングの日に子供が示した気道感染症の症状をメモしてください。
7. 2分間のサンプリング中に発生したくしゃみ、しつこい泣き声、または鼻出血を記録します。

>2. 気道免疫メディエーターの定量化

1. 冷凍庫から最大10個のランダムサンプルを採取します。識別番号を記録します。作業プロセス全体を通して、サンプルを氷の上に保ちます。
2. 氷上で解凍した後、両方の鼻孔から採取した濾紙(被験者ごと)を、バッファー25 mLあたり1つの完全なプロテアーゼ阻害剤錠剤(材料表を参照)を含む300 μLの新たに調製したバッファー(材料表を参照)に浸します。
   1. 濾紙のサイズに応じてバッファーの容量を調整します。
      3
      1. x 15 mmサイズの濾紙には300 μLのバッファーを使用してください。
      2. 濾紙が1枚しかない場合は、バッファー容量の半分(150μL)を使用してください。
3. サンプルをプレートシェーカー(400rpm)に5分間移し、タイマーを使用します。
4. 湿った濾紙とアッセイバッファーを、微量遠心チューブ内に置いたセルロースアセテートチューブフィルター(孔径0.22 μm)のカップに移します(材料の表を参照)。
5. 冷却した遠心分離機(4°C)で16,000 x gで5分間遠心分離し、チューブ内でろ過された鼻抽出物を得ます。
6. カップを取り外し、チューブを氷上に保ちながら、鼻抽出物を低タンパク質結合保存プレートのウェルに分注します(材料の表を参照)。
7. 分析まで-80°Cで保存してください。
8. 高感度の電気化学発光ベースのマルチプレックスアレイシステムを使用して、鼻抽出物中のサイトカインとケモカインの濃度を決定します(材料の表を参照)。
   c:ヒト10プレックスT_H1/T_H2サイトカインアッセイ、9プレックスケモカインアッセイ、およびシングルプレックスインターロイキン-17A(IL-17A)、トランスフォーミング成長因子-β1(TGF-β1)、および胸腺間質リンポポエチン(TSLP)をここで実施しました。
   1. アッセイでは、鼻抽出物を4°Cで一晩インキュベートします。標準的なメーカーのプロトコルに従って測定を実施します(材料の表を参照)。
      手記：イムノアッセイ(材料の表を参照)は、通常、1〜10,000 pg/mLの範囲の測定に高いダイナミックレンジを持っていますが、一部のアッセイでは100,000 pg/mLになることもあります。これは、すべてのサンプルを同じ希釈で分析できるため、他の同様のイムノアッセイの場合のように、健康な被験者と病気の被験者における異なる希釈の影響を制限できることを意味します。すべてのサイトカインの検出下限は1 pg/mL以下であり、ケモカインの検出下限は1〜50 pg/mLの範囲であった。TSLPは、生後1か月でサンプルの98%で検出できませんでした。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
繊維状ヒドロキシル化ポリエステルシート	アキュウィックウルトラ	SPR0730	濾紙
ミリプレックスアッセイバッファー	ミリポア	L-AB	バッファ
低タンパク結合保存プレート	サーモサイエンティフィック	CLS8161	プレート
プロテアーゼ阻害剤	ロシュ	11873580001	EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル
マルチスポットプレートのリーダー	メソスケール	NAの	セクターイメージャー6000
アッセイ	メソスケール		ヒト10プレックスTH1 / TH2サイトカインアッセイおよび9プレックスケモカインアッセイ、およびシングルプレックスIL-17A、TGF-β1およびTSLP。説明は www.mesoscale.com でオンラインで確認できます

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