プロテアーゼのタンパク質分解活性をスクリーニングするための蛍光性ペプチド切断アッセイ

Abstract

出典: Jaimes, J. A., et al. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (2019年)。

このビデオでは、蛍光ペプチドを使用してプロテアーゼのタンパク質分解活性をスクリーニングするアッセイを示しています。プロテアーゼはペプチド上の切断部位を認識し、ペプチドを切断してクエンチャーを蛍光色素から分離し、蛍光発光を可能にします。蛍光シグナルを検出および分析して、さまざまなペプチドバリアントの切断効率を確認します。

Protocol

1. ペプチドの設計と調製

1. NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)やウイルス病原体データベース(https://www.viprbrc.org)などの公開データベースから目的の融合タンパク質の配列を取得します。融合ペプチドに先行するプロテアーゼ認識部位を選択し、この配列の上流および下流に2〜3個のアミノ酸を含めます。
2. ペプチドを注文する際は、N末端にFRETペアの7-メトキシクマリン-4-イルアセチル(MCA)、C末端にN-2,4-ジニトロフェニル(DNP)を付けて修飾してください
   手記： いくつかのサプライヤーがこれらの変更を提供しています。価格と納期は、選択したサプライヤーによって異なります。ただし、感度にばらつきがあり、波長に関してプレートリーダーを調整する必要がある代替の変更が存在します。
3. 製造元の推奨に従って、ペプチドをゆっくりと上下に動かして再懸濁します。例えば、ペプチドを70%エタノールに再懸濁し、最終濃度1 mMにします。
4. 必要に応じて、ペプチドと溶媒を含むチューブを、ピペッティングによってペプチドが再懸濁しにくい場合は、完全に再懸濁されるまで超音波処理槽に加えます。
5. ペプチドを光減衰チューブまたは耐性チューブに分注して、ペプチドを漂白から保護します。アリコートのサイズを小さくして、複数回の凍結/融解....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ペプチド	バイオマティック	該当なし
風鈴	NEBの	P8077S型
トリプシン、TPCK処理	シグマ・アルドリッチ	4352157から1KT
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	C1016
2-メルカプトエタノール	シグマ・アルドリッチ	M6250
トリトン-X100	シグマ・アルドリッチ	X100
PBSの	コーニング	21-040-履歴書
SpectraMax ジェミニ XPS	分子デバイス	XPSの
SoftMax Pro 6.5.1	分子デバイス	該当なし
96ウェルプレート(底が平らで未処理の黒色無垢ポリスチレン)	共演者	3915
光ダンピングチューブ	ワトソン研究所	131-915BL または 131-915BR