プロテアーゼのタンパク質分解活性をスクリーニングするための蛍光性ペプチド切断アッセイ

要約

出典: Jaimes, J. A., et al. A Fluorogenic Peptide Cleavage Assay to Screen for Proteolytic Activity: Applications for coronavirus spike protein activation. J. Vis. Exp. (2019年)。

このビデオでは、蛍光ペプチドを使用してプロテアーゼのタンパク質分解活性をスクリーニングするアッセイを示しています。プロテアーゼはペプチド上の切断部位を認識し、ペプチドを切断してクエンチャーを蛍光色素から分離し、蛍光発光を可能にします。蛍光シグナルを検出および分析して、さまざまなペプチドバリアントの切断効率を確認します。

プロトコル

1. ペプチドの設計と調製

1. NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)やウイルス病原体データベース(https://www.viprbrc.org)などの公開データベースから目的の融合タンパク質の配列を取得します。融合ペプチドに先行するプロテアーゼ認識部位を選択し、この配列の上流および下流に2〜3個のアミノ酸を含めます。
2. ペプチドを注文する際は、N末端にFRETペアの7-メトキシクマリン-4-イルアセチル(MCA)、C末端にN-2,4-ジニトロフェニル(DNP)を付けて修飾してください
   手記： いくつかのサプライヤーがこれらの変更を提供しています。価格と納期は、選択したサプライヤーによって異なります。ただし、感度にばらつきがあり、波長に関してプレートリーダーを調整する必要がある代替の変更が存在します。
3. 製造元の推奨に従って、ペプチドをゆっくりと上下に動かして再懸濁します。例えば、ペプチドを70%エタノールに再懸濁し、最終濃度1 mMにします。
4. 必要に応じて、ペプチドと溶媒を含むチューブを、ピペッティングによってペプチドが再懸濁しにくい場合は、完全に再懸濁されるまで超音波処理槽に加えます。
5. ペプチドを光減衰チューブまたは耐性チューブに分注して、ペプチドを漂白から保護します。アリコートのサイズを小さくして、複数回の凍結/融解サイクル(例:100 μL)を避けてください。アリコートは-20°Cで保管してください。

2. 蛍光プレートリーダーの準備

1. プレートリーダーの電源を入れ、セルフテストが終了するまで待ちます。
2. 付属のコンピューターでオペレーティングソフトウェアを開き、プレートリーダーに接続されていることを確認します。
3. 温度設定を開き、30°C(またはプロテアーゼの最適なパフォーマンスに必要な温度)に設定します。
4. [制御] |実験をセットアップするための装置のセットアップ。
5. [キネティック]を選択します。
6. [蛍光]を選択します。
7. 励起波長と発光波長を入力します:それぞれ330nmと390nm。
8. [自動カットオフ]の選択を解除します。
9. 中、通常の感度を選択します。
10. アッセイの実行時間を1時間に設定し、60秒ごとに1回の測定を選択します。
11. 最初の測定の前に5秒のミキシングを設定し、各測定の3秒前にミキシングを設定します
12. 読み取るウェルを選択し、アッセイを開始します。

3. アッセイの準備

1. アッセイバッファーは、各成分の適切な量を計算して添加することにより調製します。フリンについては、100 mM HEPES、1 mM CaCl₂、1 mM 2-メルカプトエタノール、および5%Triton X-100からなる緩衝液を作製します。トリプシンの場合は、標準的なリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液を使用してください.
   手記：10mL以下の容量で十分です。アッセイで使用されるプロテアーゼに応じて、バッファーは異なります。
2. バッファを氷の上で冷やします。
3. アッセイプレートを氷の上に置き、その下に薄い金属プレートを敷いて冷却と安定性をサポートします。底が平らで未処理の黒無垢のポリスチレン製96ウェルプレートを使用してください。
   手記：隣接するウェルからの蛍光灯の「漏れ」を防ぐために、黒いプレートを使用することが不可欠です。
4. 過去の論文や実験データに基づいて、各反応に添加するプロテアーゼの適切な量を計算します。フリンの場合、1反応につき1ユニット(0.5μL相当)をご使用ください。トリプシンには、0.5 μL の 160 nM TPCK トリプシンを使用します。
5. サンプルごとに、サンプルあたり総容量100μLでアッセイごとに3回のテクニカルリピートを準備します.
   手記：ピペッティングが通常の光条件下で行われるか、調光される光の下で行われるかにかかわらず、違いはないことを実験的に評価しました。ただし、ペプチドを長時間光にさらさないでください。
6. 適切な量のアッセイバッファー(ステップ3.1に記載の94.5 μL)を各ウェルにピペットで注入します。
7. 各ウェルにプロテアーゼを添加します。フューリンとTPCKトリプシンの両方で、サンプルあたり0.5μLを使用します。6ウェル(ブランクコントロール用に3ウェル、ペプチドコントロール用に3ウェル)に、それぞれのプロテアーゼの代わりに0.5 μLのバッファーを加えます。
8. ブランクコントロールを除く各ウェルでペプチドを最終濃度50 μMまで添加します。この場合、ステップ1.3で説明したように、ピペット5μLペプチドを調製しました。ペプチドの代わりに5 μLのバッファーをブランクコントロールに加えます.
   手記：ペプチドのいくつかの濃度を最初に記載された酵素濃度で試験し、酵素が飽和していることを確認しました。
9. プレートを蛍光プレートリーダーに挿入し、[開始]をクリックします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ペプチド	バイオマティック	該当なし
風鈴	NEBの	P8077S型
トリプシン、TPCK処理	シグマ・アルドリッチ	4352157から1KT
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	C1016
2-メルカプトエタノール	シグマ・アルドリッチ	M6250
トリトン-X100	シグマ・アルドリッチ	X100
PBSの	コーニング	21-040-履歴書
SpectraMax ジェミニ XPS	分子デバイス	XPSの
SoftMax Pro 6.5.1	分子デバイス	該当なし
96ウェルプレート(底が平らで未処理の黒色無垢ポリスチレン)	共演者	3915
光ダンピングチューブ	ワトソン研究所	131-915BL または 131-915BR