官能基化ナノボディを用いたトランスゴルジ体ネットワークへのGFPタグ付き表面タンパク質の到着のモニタリング

要約

出典:Buser, D. P., et al. 培養細胞における官能基化ナノボディを用いたトランスゴルジネットワークへのエンドサイトーシス取り込みと逆行性輸送の解析。J. Vis. Exp.(2019年)。

このビデオは、官能基化されたナノボディの取り込みと逆行性輸送を研究し、その細胞内輸送経路を理解する方法を示しています。放射性標識硫酸塩を導入し、単離および検出技術を利用することにより、この方法は、カーゴタンパク質のエンドサイトーシス取り込みとトランスゴルジネットワークの到着の研究を可能にします。

プロトコル

1. 培養細胞による機能性ナノボディの取り込み(サルフェーショナル分析用)

1. 細胞培養フードで、GFPタグ付きレポータータンパク質を安定して発現する~400,000〜500,000のHeLa細胞を35 mmディッシュまたは抗生物質を含む完全培地(Dulbecco's Modified Eagle培地、DMEM、10%ウシ胎児血清(FCS)、100ユニット/mLストレプトマイシン、2 mM l-グルタミン、および1.5 μg/mLピューロマイシンを添加)を含む完全な培地で35 mmディッシュまたは6ウェルクラスター上に播種します。
   手記： 上述の通り、ここではEGFP-Calnexin、EGFP-CDMPR、TfR-EGFPを安定的に発現するHeLa細胞を例示のために用います。安定細胞株以外にも、一過性にトランスフェクトしたHeLaも使用できます。
2. 細胞O/Nを7.5%_CO2インキュベーターで37°Cでインキュベートし、増殖させます
   手記： 細胞のコンフルエント度は、翌日には~80%であるはずです。
3. 培地全体を取り出し、室温で1x PBSで2回洗浄し、7.5%_CO2インキュベーターで37°Cの硫酸フリー培地(SFM)で1時間細胞を飢餓状態にします
   手記：SFMは、10 mLのMEMアミノ酸(50倍)溶液、5 mLのL-グルタミン(200 mM)、5 mLのビタミン溶液(100倍)、および900 μLのCaCl₂·2H₂Oを500 mLのイーグルズバランス塩に加えて調製します。0.22μmのフィルターを通過し、分注します。
4. 放射能作業用に指定された換気されたフードまたはベンチで、SFM.
   のナトリウム塩として 0.5 mCi/mL [³⁵S] の硫酸塩を含む硫酸塩標識媒体を準備します 注意：放射能を含むすべての溶液を慎重に取り扱ってください。指定されたフードまたはベンチでのみ作業してください。放射能と接触するすべての材料(チップ、チューブ、プレートなど)または洗浄バッファーは、個別に収集して廃棄する必要があります。以下のすべてのステップ(ステップ1.5〜1.18)でもこれを行います。
5. 1x PBS中のVHH-2xTSを硫酸塩標識媒体に添加し、最終濃度2 μg/mL.
   手記： コントロールとして、VHH-stdまたはTS部位を欠く別のナノボディも含めて、特異的な標識を実証します。
6. SFMを0.5 mCi/mL [35S]硫酸塩と2 μg/mL VHH-2xTSを含む0.7 mLの硫酸標識培地と交換し、放射能を扱う作業用に指定された7.5% CO₂インキュベーターで細胞を37°Cで1時間インキュベートします
   手記：計画された実験に応じて、ナノボディサルフェーションの時間を調整する必要があります。さらに、TGNの到着速度を決定するために、標識は異なる時間(例えば、10分、20分、30分など)に対して行われる。
7. 標識培地を取り出し、冷却プレートまたは氷上で氷冷した1x PBSで細胞を2〜3回洗浄します。
8. 2 mM PMSFおよび1xプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加した溶解緩衝液(1% Triton X-100および0.5%デオキシコール酸を含むPBS)1 mLを添加し、4°Cのロッキングプラットホーム上で細胞を10〜15分間インキュベー
トします。
9. ライセートをこすり落とし、1.5 mLチューブに移し、ライセートをボルテックスし、4°Cのエンドオーバーエンドローテーターに10〜15分間置きます。
10. 核後ライセートを10,000 x gで遠心分離し、4°Cで10分間調製します。
11. 新しい1.5 mLチューブを使用して、1.5 mLチューブにニッケルビーズのスラリー20〜30 μLを調製し、1x PBSで1,000 x gで1分間
    手記：ニッケルビーズの代わりに、ストレプトアビジンビーズ(ナノボディがビオチン化されている場合)またはナノボディのエピトープに対してIgGを含有するプロテインAビーズ(T7またはHAタグ)を使用することができます。
12. 核後ライセートをニッケルビーズを含む1.5 mLチューブに移し、エンドオーバーエンドローテーターで4°Cで1時間インキュベートしてナノボディを単離します。核後ライセートのアリコート(50-100 μL)を取り出し、SDSサンプルバッファーで煮沸して、その後の全細胞関連ナノボディ、GFPレポーター、およびローディングコントロールのイムノブロット分析を行います。
13. ビーズを1x PBSまたは溶解バッファーで3回洗浄し、1,000 x gで1分間穏やかにペレット化します
    手記：ビーズをより厳密に洗浄するために、20 mMのイミダゾールをPBSまたは溶解バッファーに含めることができます。
14. ビーズからすべての洗浄バッファーを慎重に取り除き、2xサンプルバッファー50μLを加え、95°Cで5分間煮沸します。
15. 茹でたビーズの両方をmidi 12.5% SDS-PAGEゲルにロードし、標準PAGEプロトコルに従って、参照色素(ブロモフェノールブルーなど)が分離ゲルの終わりに達するまで泳動します
    手記：全細胞関連ナノボディ、GFPレポーター、およびローディングコントロールのイムノブロット解析は、ミニ12.5% SDS-PAGEまたはプレキャストグラジエントゲルを使用して行うこともできます。
16. 分離ゲルを~30 mLの固定緩衝液(10%酢酸と45%メタノール、ddH₂O溶液)に室温で1時間固定し、ゲルを~50 mLの脱イオン水で3回洗浄し、ゲル乾燥の準備
をします。
17. SDS-PAGEゲルの乾燥。​
    1. 固定ゲルを伸ばしたラップフィルムに慎重に置き、事前にカットされた濾紙で覆います。
    2. 濾紙を下にしてゲルを乾燥台の上に置き、真空カバーを置き、真空ポンプのスイッチを入れてゲル乾燥させます。ゲルを3〜5時間乾燥させます。
    3. ラップフィルムをはがし、乾燥させたゲルを蛍光体スクリーン付きのオートラジオグラフィーカセットに入れます。
18. 蛍光体スクリーンイメージャーを使用した画像オートラジオグラフ。メーカーの指示に従ってください
    手記：シグナルの強度にもよりますが、乾燥したゲルは蛍光体スクリーンでより長く露光する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
抗GFP抗体	シグマ・アルドリッチ	1.18145E+11	製品はSigmaAldrichによって配布されていますが、Rocheによって製造されています
ダルベッコの修正イーグルスミディアム(DMEM)	シグマ・アルドリッチ
子牛胎児血清(FCS)	バイオウエスト
硫酸ナトリウムとしての硫黄-35	ハルトマン・アナリティクス	ARS0105	製品には5 mCiが含まれています
6ウェルプレート	TPPとは	92406
パラホルムアルデヒド(PFA)	アプリケム	A3813の
フルオロマウント-G	サザンバイオテクノロジー	0100-01
ミニプロティアンTGXゲル、4-20%、15ウェル	バイオ・ラッド	〒456-1096