寄生虫感染赤血球の抗体媒介性食作用の定量化のためのアッセイ

要約

出典:キンタナ、MDP. et al., フローサイトメトリーベースのアッセイによる熱帯熱マラリア原虫寄生虫に対する自然獲得食作用誘導抗体の測定. J. Vis. Exp. (2020)

このビデオでは、単球による標識およびオプソニン化された熱帯熱マラリア原虫感染赤血球を含むフローサイトメトリーベースの食作用アッセイを実演しています。フローサイトメトリーは、単球の蛍光を同定し、食作用によるオプソニン化赤血球の同定に成功したことを裏付けています。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 寄生虫の文化

注:ヒトの病原体の取り扱いについては、地域の規制に従ってください。

1. 熱帯熱マラリア原虫の寄生虫は、寄生虫培地で前述した標準プロトコルに従って維持します(材料表を参照)。
2. 前述のようにソルビトール処理を使用して寄生虫をしっかりと同期させます。
3. 熱帯熱マラリア原虫に感染した赤血球(IE)の表面でのVAR2CSA発現を確実にするために、抗VAR2CSA抗体(PAM1.4抗体、交差反応性ヒトモノクローナルVAR2CSA特異的IgG)をタンパク質G磁気ビーズに結合して、免疫磁気選択を繰り返し行います。
   1. 簡単に言うと、後期のトロフォゾイトIEを磁気ビーズと抗VAR2CSA抗体でインキュベートし、磁石を使用して正選択します。
   2. 寄生虫症が少なくとも5%になるまで、選択した寄生虫を培養中に数サイクル拡大します。
   3. あるいは、前述のように、プラスチック固定化CSA(VAR2CSAの受容体)に結合する寄生虫を選択します。
4. 選択した寄生虫に対するVAR2CSA発現を確認するために、前述のようにフローサイトメトリーを実施します。
   1. 簡単に言うと、後期栄養型IEを磁気選択に使用したのと同じ抗体で標識し(ステップ1.3)、続いて蛍光標識した二次抗体
   を標識します。
   2. IEの表面反応性をフローサイトメトリーで測定します。抗体の選択が成功すると、通常、ほとんどの寄生虫でVAR2CSAを発現する寄生虫集団が得られます(≈80%)。
5. 食作用アッセイには、精製された中期から後期の栄養型-IEを使用します。前述のように磁気分離を使用して精製を行います.
   手記：寄生虫の病期を正確に特定するために、血液塗抹標本のギムサ染色を行った後、光学顕微鏡観察を行います。前述の標準的な手順と形態学的ガイドラインに従ってください。後期精製は、密度勾配培地を使用して行うこともできます。しかし、私たちの経験ではIEの収率は低いため、磁気精製が望ましいです。
   1. 磁気分離のためには、寄生虫培養物(5-10%寄生虫症)を500 x gで室温で10分間遠心します。上清を取り除き、細胞ペレットを寄生虫培養液10 mLに再懸濁します。
   2. 寄生虫懸濁液を磁石に結合したClaricep Flash Silica、CSカラム(材料表を参照)に加え、カラムをゆっくりと通過させます。Trophozoite-IEsは常磁性体であり(ヘモゾインの存在による)、カラムメッシュに留まります。
   3. カラムを 50 mL の寄生虫培養液で洗浄し、50 mL の寄生虫培養液を使用して磁気カラムから IE を溶出します。
6. 溶出液を 1.5.3 から 500 x g で室温で 10 分間遠心します。上清を慎重に捨て、寄生虫培地1mLに再懸濁します。
7. 血球計算盤を使用して、IEの数(光学顕微鏡で暗いヘモゾイン色素を持つ赤血球として簡単に識別できます)と総細胞数をカウントして、最終的な寄生虫血症(IEの割合)を計算します
   手記：純度が80%以上の寄生虫のみを使用してください(IEは80%)。
8. 試験予定の血清/抗体サンプル数に基づき、必要なIEの総量を推定し、それに応じて寄生虫の培養をスケールアップします。5%ヘマトクリット値と5-10%寄生虫症の25 mLの培養液を含む75 cm²培養フラスコは、96ウェルプレートをフルに実行するのに十分なIEを生成するはずです。フルプレート(42 サンプルと 6 つのコントロールを二重に含む)の場合、3.3 x 10⁷ IEs/mL で最低 1.5 mL の寄生虫懸濁液が必要です。

2. THP-1 セル

注:このアッセイではTHP-1細胞株が使用されます。この単球細胞株は、単球性白血病の患者に由来し、American Type Culture Collection(ATCC)から購入できます。THP-1培地でプロバイダーの指示に従って細胞株を維持します(材料の表を参照)。

1. 定期的なメンテナンスのために、THP-1細胞の培養を2-4 x 10⁵細胞/mLで開始し、細胞濃度が8 x 10⁵細胞/mLに達したら継代培養します
   手記：細胞濃度が1 x 10⁶細胞/mLを超えないようにし、継代数を記録してください。継代25を超える細胞の使用は避ける。THP-1細胞株の平均倍加時間は19〜50時間の間で変動します。食作用実験を開始する前に、細胞バッチの倍加時間を決定します。これは、試験する血清サンプルの数を決定するために必要な培養物の量を概算するのに役立ちます(例えば、96ウェルプレート全体の場合、5 x 10 5細胞/mLで10 mLの培養が必要です)。
2. 前述のように、THP-1細胞のFcγ受容体I(CD64)、II(CD32)、およびIII(CD16)の表面発現を定期的にチェックします。
   1. 簡単に言うと、THP-1細胞を(別々に)抗CD64、抗CD32、および抗CD16蛍光標識抗体(材料表)で30分間染色します(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2%ウシ胎児血清(FBS)で調製した1:100希釈)。
   2. PBS中の2% FBSで3回洗浄し、フローサイトメトリーで表面染色を測定します。
      手記：THP-1細胞は、以前に報告されているように、CD16に対して陰性であり、CD32およびCD64に対して陽性です(図1)。
3. 食作用アッセイでは、実験前日にTHP-1細胞培養フラスコに2.5 x 10⁵細胞/mLをセットすると、アッセイ当日に約5 x 10⁵細胞/mLが得られます
   手記：アッセイ当日に4-6 x 10⁵細胞/mLが存在することを確認してください。

3. 食作用アッセイ(図2)

1. アッセイを開始する前に、PBS中の滅菌2% FBSのウェルあたり150 μLを使用して、2つの丸底96ウェルプレート(1つはオプソニン化用、もう1つは食作用用)をブロック>します
   >手記：プレート1をオプソニン化プレートとして標識し、エチジウムブロマイド(EtBr)の染色とオプソニン化の両方に使用します。プレート2を食作用プレートとしてラベル付けし、THP-1細胞プレーティングと食作用ステップの両方に使用します。
2. 寄生虫の染色とオプソニン化
   1. 1.6 で調製した IE 懸濁液を 1.6 で調製し、寄生虫培地とエチジウムブロマイド(EtBr)を添加して細胞数を 3.3 x 10⁷ IEs/mL に調整し、最終濃度 2.5 μg/mL (0.1 mg/mL ストックから 1:40 希釈) を達成します
      mL 手記：EtBrは寄生虫DNAを染色し、フローサイトメトリーによる検出を可能にします.
      注意：EtBrは変異原であり、皮膚、眼、呼吸器の刺激物です。適切な保護を使用し、地域の規制に従って廃棄物を処分してください。
   2. 96ウェルプレート(オプソニゼーションプレート)の1つからブロッキング溶液を取り出し、プレートをフリックしてタオルペーパーの上の余分な液体を取り除きます。
   3. 上記で調製したIE懸濁液のウェルあたり30 μLをプレートの上半分に添加します。ウェルを1つ空にし、寄生虫培地30 μLを加えます(THP-1単独コントロールの場合はIEなし)。(図3A)。室温で10分間インキュベートし、光から保護します。
   4. 寄生虫培地のウェルあたり170μLを添加します。プレートを500 x gで室温で3分間回転させ、適切な廃棄物容器の上でプレートをフリックして上清を取り除きます。
   5. 寄生虫培地のウェルあたり200 μLを使用して、EtBr標識IEをさらに2回洗浄し、プレートを500 x gで室温で3分間回転させます。初回洗濯時の上清は、プレートをフリックすることで取り除くことができます。マルチチャンネルピペットを使用して2回目の洗浄から上清を慎重に取り除き、洗浄媒体の全容量が除去されていることを確認します。ペレットを邪魔しないでください。
   6. 寄生虫培地で所望の濃度で調製した抗体/血漿/血清溶液30 μLにEtBr標識IEを再懸濁します。
   7. IEs/THP-1細胞コントロールなしのコントロール(寄生虫培養培地)、抗体または血漿/血清を一切使用しないコントロール(非オプソナイズコントロール)、1:100希釈の市販のウサギ抗ヒト赤血球抗体を使用したポジティブコントロール(材料表を参照)を必ず含めてください(図3B));1:5 希釈で 2 つのネガティブ プラズマ/血清コントロール (マラリア未経験のプールとマラリアに曝露した男性のプール);1:5希釈での陽性血清コントロール(以前に妊娠していたマラリアにさらされた女性(できれば多胎)からのプール).
      手記：ポジティブコントロールの1:100希釈は、購入した抗体の異なるバッチ間で一貫して機能するようです(データは示されていません)。ただし、新しい抗体のバッチを使用するたびに数回の希釈試験を行うことで、バッチ間のばらつきを除外することをお勧めします。
   8. 暗所、37°Cで45分間インキュベートします。
3. THP-1細胞の調製と食作用
   1. IEがオプソニン化されている間(3.2.8)、THP-1細胞の準備を開始します。
   2. THP-1細胞を培養フラスコから取り出し、スピンダウン(室温で500 x gで5分間)し、上清をデカントし、ペレットをTHP-1細胞培養培地に再懸濁します。
   3. 再度遠心(室温で500 x g、5分間)し、上清をデカントし、細胞ペレットをTHP-1細胞培養培地1 mLに再懸濁します。
   4. 上記で調製した溶液中の細胞数を測定し、培地をさらに添加して最終濃度5 x 10⁵細胞/mLを得ます。
   5. 残りの96ウェルプレート(食作用プレート)からブロッキング溶液をフリックし、タオルペーパーの上の余分な液体を取り除きます。
   6. 3.3.4で調製したTHP-1細胞懸濁液のウェルあたり100μLを加え、細胞培養インキュベーターに戻します(図3C)。
   7. 抗体/血漿/血清のインキュベーション時間が終了したら、寄生虫培地のウェルあたり170 μLを添加します。プレートを500 x gで室温で3分間回転させ、適切な廃棄物容器の上でプレートをフリックして上清を取り除きます。
   8. オプソニン化したIEを、寄生虫培地のウェルあたり200 μLを使用してさらに2回洗浄し、プレートを500 x gで室温で3分間回転させます。初回洗濯時の上清は、プレートをフリックすることで取り除くことができます。マルチチャンネルピペットを使用して、2回目の洗浄から上清を慎重に取り除き、洗浄媒体の全量が除去されていることを確認します。ペレットを邪魔しないでください。
   9. 最後に、オプソニン化したIEを100 μLの予熱済みTHP-1細胞培養培地に再懸濁します。50 μLのオプソニン化IE懸濁液を食作用プレートの各ウェルに移します。IEは合計100 μLあるため、各抗体/血清希釈液は、食作用プレート(図3D)で重複して実行できます
      手記：アッセイで使用されるIEおよびTHP-1細胞の量は、10:1の比率に対応します。
   10. 暗所37°C、5%二酸化炭素(CO₂).
       で40分間インキュベートします。 手記：食作用を40分以上進行させないでください。
   11. 4°C(500 x g、5分)で遠心分離して食作用を停止し、プレートをフリックして上清を捨てます。室温の塩化アンモニウム溶解液150μL(Table of Materials)を加え、ピペッティングで混合し、正確に3分間インキュベートします
       手記：このステップでは、THP-1細胞によって食作用されていない赤血球を溶解します。
   12. PBSに氷冷した2%FBS100μLを加えて溶解を停止します。プレートを4°C(500 x gで3分間)で回転させ、適切な廃棄物容器の上でプレートをフリックして上清を取り除きます。
   13. 氷冷した2% FBSをPBS中でウェルあたり200 μLで3回洗浄し、プレートを4°Cで回転させます(500 x gで3分間)。最終洗浄後、PBS中の氷冷2%FBS200μLに再懸濁し、直ちにフローサイトメトリーで解析します><。 手記：これまでの論文では、フローサイトメト^リー31の前に2%パラホルムアルデヒドに細胞固定を行っていましたが、ここで紹介する結果はアッセイ完了直後に得られたものです。プレートを4°Cで保存してフローサイトメトリーデータの取得を延期することは、EtBr⁺ THP-1細胞の割合が急速に低下するため、推奨されません(図4)。

4. フローサイトメトリーの取得と解析

注:96ウェルプレートフォーマットをサポートし、EtBr蛍光を測定するための適切なレーザー/フィルターを備えた任意のフローサイトメーターを使用することができます。

1. 取得には、IEが追加されていないウェル(図2A)を使用して、線形前方散乱(FSC)と線形側方散乱(SSC)プロットを使用してTHP-1セルをゲートし、このゲートで10,000イベントを取得します。
2. ヒストグラムプロットを使用して、THP-1ゲート上のEtBr(FL3-Log)の蛍光強度を測定します。
3. ゲーティングでは、まず、IEが添加されていないウェルを使用して、FSC対SSC密度プロットでTHP-1セルをゲートします(図5A)。次に、THP-1セル(IEは追加されていない)と非オプソナイゼーションコントロール(図5B)を使用して、FL3(EtBr)ヒストグラムにポジティブゲートを設定します。
4. これらのゲートを同じプレートで試験した他のすべてのサンプルにコピーし、EtBr陽性THP-1細胞(少なくとも1つのIEを食作用させたTHP-1細胞)の割合を決定します。試験した各サンプルについて、食作用は絶対値(EtBr⁺ THP-1細胞の割合)として報告することも、陽性対照を最大値として使用した割合として計算された相対食作用として報告することもできます。

結果

図1:THP-1細胞表面に発現するFc受容体。 (A)Fcγ受容体III/CD16(赤)。(B)Fcγ受容体II/CD32(緑)、C.Fcγ受容体I/CD64(オレンジ)。ラベル付けされていないセルは青色で表示されます。

図2:食作用アッセイのフローチャート。アッセイの主なステップを示すフローチャート。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェル細胞培養プレート、丸底、蓋付き	コーニング	3799	同様のプレートを使用できますが、使用する予定のフローサイトメーター機器と互換性があることを確認してください
アルブMAX-II	ギブコ	11021-037
アルブMAX-II(5%)	-	-	5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L ヒポキサンチン (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
抗赤血球抗体	アブカム	ab34858	アリコートを調製し、-20°Cで凍結し、1回の実験につき1つのアリコートを使用します。
DPBSの	シグマ	P8622
Dynabeads プロテインG	インビトゲン	10003Dの
臭化エチジウム溶液	シグマ	E1510	RPMI1640(R5886)に0.1 mg / mLの原液を調製します。光から保護された保管
FC500 フローサイトメーター	ベックマン・コールター		96ウェルプレートフォーマットをサポートし、EtBr蛍光を測定するための適切なレーザー/フィルターを備えたフローサイトメーターであれば、どれでも使用できます。
ウシ胎児血清(FBS)	ギブコ	10099-141	使用前に熱を不活性化します。
FITCマウス抗ヒトCD16	BDバイオサイエンス	555406または556618
FITCマウス抗ヒトCD32	BDバイオサイエンス	552883
FITCマウス反ヒトCD64	BDバイオサイエンス	555527
FlowLogicソフトウェア	イニバイの技術		FlowJoやWinlistなど、あらゆるフローサイトメトリー解析を使用することができます
ゲンタマイシン(10mg/mL)	シグマ	G1272
ヒポキサンチン	シグマ	H9377-J
L-グルタミン (200mM)	シグマ	G7513
ライジングソリューション	-	-	15mM NH4Cl、10mM NaHCO3、1mM EDTA
MACS CSカラムとアクセサリー	ミルテニーバイオテック	〒130-041-305
寄生虫培地	-	-	2mM L-グルタミン(Sigma、G7513)、50μg/mLゲンタマイシン(Sigma、G1272)、0.5% AlbuMAX-II(AlbuMAX-II 5%)、RPMI1640(Sigma、R5886)
ペニシリン/ストレプトマイシン(10000Uおよび10mg / mL)	シグマ	P0781
RPMI-1640 ミディアム	シグマ	R5886
THP-1培地	-	-	10%FBS(Gibco、10099-141)、2mM L-グルタミン(Sigma、G7513)、100U / mLペニシリン、0.1mg / mLストレプトマイシン(Sigma、P0781)RPMI1640(Sigma、R5886)
バリオMACSマグネット	ミルテニーバイオテック

名 型 の の