蛍光レポーターを用いた好中球セリンプロテアーゼ活性測定のためのin vitroアッセイ

要約

出典:Frey, D. L., et al. ヒト喀痰サンプル中の好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性のモニタリング. J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオは、喀痰サンプル中の好中球セリンプロテアーゼ活性を定量化するin vitroアッセイを示しています。分泌されたプロテアーゼを含むサンプルは、認識モチーフを持つ蛍光レポーターとインキュベートされます。プロテアーゼによるモチーフの切断により、レポーターのドナーおよびアクセプター蛍光色素による個々の蛍光発光が可能になり、サンプル中のプロテアーゼ活性が示されます。

プロトコル

>注:以下のプロトコルは、好中球セリンプロテアーゼ(NSP)活性のサンプル調製と定量化を説明しています。ここで提示する実験手順は、ヒトの喀痰および好中球エラスターゼ(NE)またはカテプシンG(CG)活性測定に焦点を当てています。しかし、サンプル調製プロトコルのわずかな適応により、血液由来細胞や腫瘍ホモジネートの分析が可能になります。さらに、マトリックスメタロプロテイナーゼとカテプシンSの活性は、専用のFRETプローブを使用して同様に調査できます

1. サンプル調製:細胞単離と上清分離

>注:可能であれば、喀痰の治療は去痰後120分以内に実施し、喀痰はさらなる処理まで氷上に保存する必要があります。

1. 痰の自発的な去痰が不可能な場合は、前述のように痰を誘発します。簡単に言えば、喀痰導入手順を開始する前に、200μgのβ-2受容体拮抗薬サルブタモールを吸入します。その後、ネブライザーを使用して高張性(6%)生理食塩水を15分間吸入します。去痰をペトリ皿に集めます。
2. ピペットチップの助けを借りて、粘液の塊を唾液からペトリ皿に分離します。
3. 粘液の重さを量ります.
   手記：粘液サンプルの平均重量は0.8 g(0.1 gから5 gの間で変動)です。通常、0.1 gは、上記の手順を実行するのに十分です。
4. 10%スプトリシン(PBS中)を4部(v / w)を ?? 毒 ?? 吐に追加します(たとえば、 ?? 速1グラムあたり4 mLの10%スプトリシン><)。. 注意：スプトリシンはリン酸緩衝液中に濃縮されたジチオスレイトールで構成されていますので、取り扱いには注意が必要です。
5. 混合物を室温(RT)でロッキングシェーカーで15分間インキュベートし、粘液を溶解します。安全上の理由から、シェーカーをドラフト
に入れてください。
6. 同量の冷PBSを加えて反応を急冷します(例:10%スプトリシン1mLごとに1mLの冷PBS)。
7. ピペッティングで混合して、均質な溶液を得ます。
8. 混合物を100 μmのナイロンセルストレーナーで50 mLのチューブにろ過します。
9. 40 μmのナイロンセルストレーナーを使用してろ過ステップを繰り返します。
10. 溶液を300 x g、4°Cで10分間遠心分離します。
11. 上清画分を新しいチューブに注意深く移し、氷の上に保存します.
    手記：上清画分は、さらなる分析まで-20°Cまたは-80°Cで保存できます。
12. 細胞ペレットを500μLの冷たいPBSに穏やかに再懸濁し、氷の上に置きます
    手記：細胞分画はすぐに処理する必要があります。

2. 好中球セリンプロテアーゼ活性測定

>注:ここでは、FRETレポーターによってNSPの活動を定量化するためのさまざまな方法が紹介されています。技術の選択は、特定の生物医学的問題と実験の目的によって決定されます。提示されたプローブは、肺関連酵素のセットに対する特異性について広範囲に試験されました。プローブは標的酵素に特異的ですが、目的の臨床サンプルのプローブ特異性を常に確認してください。これは、プローブ添加前にサンプルを特定のプロテアーゼ阻害剤とインキュベートすることで達成でき、これによりドナー/アクセプター(D / A)比の増加がなくなります。

1. 蛍光計またはプレートリーダーアッセイによる可溶性NSPの活性定量
   手記：サンプルの可溶性画分中のプロテアーゼ活性は、蛍光検出が可能な任意の装置で検出できます。
   1. 氷上で酵素を解凍します。
   2. 使用時までは、NEおよびCGを酸性保存バッファー(50 mM酢酸ナトリウム、200 mM NaCl、pH 5.5)に保管して、自己切断を防ぎます。
   3. 酵素標準曲線を設定するには、活性化バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 7.5 で 500 mM NaCl)で酵素の 1:2 段階希釈(NE は 33.9 - 0.271 nM、CG は 42.6 - 0.333 nM)を調製します。活性化バッファーのpHは中性であるため、酵素触媒作用を効率的に行うことができます。
      1. 最高標準濃度(NE濃度:33.9 nM)を調製するには、1 μLのNE(33.9 μM)を999 μLの活性化バッファーで希釈します。
      2. 2番目の標準試料(NE濃度:16.95 nM)を調製するには、1回目の希釈液200 μLと活性化バッファー200 μLを混合します。
      3. それに応じて、残りの1:2希釈液を調製します。
      4. 最後の標準 (ブランク) は、純粋な活動化バッファーから構成されます。技術的な重複または三重の測定をお勧めします。標準試料およびサンプル調製中は、バイアルを氷上に保管するようにしてください。
   4. 標準調製と並行して、喀痰サンプルを活性化バッファーで希釈します。ヒトサンプルを希釈してから、そのプロテアーゼ活性を評価し、レポーターシグナルの直線的な増加範囲(D/A比)に留まります。患者サンプルを希釈せずに放置すると、切断が急激に進行しすぎて、信頼性の高いフィッティングができなくなります。健康なドナーの喀痰は、嚢胞性線維症(CF)および慢性閉塞性肺疾患(COPD)患者のサンプルと比較して活性プロテアーゼが少ないため、一般的に異なる希釈が行われます(健康な喀痰上清の場合は1:10、COPDまたはCF患者の喀痰上清の場合は1:20-500)
      手記：濃度が不明なサンプルのプロテアーゼ活性を定量的に測定するには、既知の酵素濃度の標準曲線を並行して、理想的には同じプレート上で測定する必要があります。ヒトの喀痰中の活性酵素の濃度は、ヒトの喀痰サンプルで測定された傾きを標準曲線で測定された傾きと補間することによって計算されます。
   5. サンプルを測定する前に、機器をセットアップします。NE Förster共鳴エネルギー移動ベース(NEmo-1)プローブ(NEmo-1)の励起波長を354 nmに設定し、検出波長をドナーが400 nm、アクセプターが490 nmに設定します。CG FRETプローブ(sSAM)の励起波長を405 nmに設定し、蛍光を485(ドナー)と580 nm(アクセプター)に設定します。
   6. 標準またはブランクのサンプル40 μLを、黒色の96ウェルハーフエリアプレートのウェルに加えます。
   7. レポーターを含むマスターミックス(マスターミックス中のレポーターの濃度:10 μM)を調製するには、プローブストック(1 mMのジメチルスルホキシド、DMSO)を活性化バッファーで1:100に希釈します。必要なマスターミックス量を調製するには、10 μL x 必要なプレートウェル数を掛けます。NEmo-1およびsSAMレポーターの蛍光測定に最適な最終濃度(2 μM)を得るには、各ウェルに10 μLのマスターミックス(サンプル、標準、またはブランクのいずれか40 μLを含む)を加え、読み取りを開始します。したがって、NEmo-1およびsSAMレポーターは、可溶性好中球エラスターゼおよびカテプシンG活性をそれぞれモニターします
      手記：試薬インジェクターが利用できない場合は、レポーターがサンプルに追加した後、できるだけ早く読み取りを開始してください。
   8. プレートリーダーの測定を開始し、60〜90秒ごとにD / A比の増加を少なくとも20分間、または信号の増加がプラトーに達するまで記録します。
   9. データがエクスポートされたら、各時点とサンプルのドナー相対蛍光単位(RFU)とアクセプターRFUを割ってD/A比を計算します。
   10. 各サンプルのD/A比、平均、および標準偏差を計算します。
   11. D/A比の変化の線形成長内の傾きを決定します。傾きは、FRETプローブの酵素切断速度の指標です。ヒトサンプルから得られた線形回帰傾きを酵素標準から計算された傾きに当てはめることにより、喀痰中の活性酵素の濃度を計算します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
100 μm ナイロンセルストレーナー	コーニング株式会社	431752
2300 EnSpire(マルチラベルプレートリーダー)	パーキンエルマー
35x10mmディッシュ、ヌンクロンデルタ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	150318
40 μm ナイロンセルストレーナー	コーニング株式会社	431750
50 mLチューブ	ザルシュテット	10535253
秤	オーハウスインスツルメンツ(上海)有限公司	PR124
BD Falcon 丸底チューブ 5 mL	BDバイオサイエンス	352054
BD LSRFortessaセルアナライザー	BDバイオサイエンス
ブラックフラットボトム96ウェルハーフエリアプレート	コーニング ライフサイエンス	3694
カテプシンG	エラスチン製品カンパニー	SG623
カテプシンG阻害剤I	メルク KGaA	219372
遠心分離機 5418R	エッペンドルフAG	EP5401000137
コンビティップアドバンスド 1.0 mL	エッペンドルフAG	0030 089 430
完全プロテイナーゼ阻害剤	ロシュ	11697498001
ヒト喀痰白血球エラスターゼ	エラスチン製品カンパニー	SE563
マルチペットプラス	エッペンドルフAG
ネオ1	サイシェム	SC-0200	1 mM
ネモ-2E	サイシェム	SC-0201	2 mM
パリボーイSXとLCスプリントジェットネブライザー	パリ	085G3001
リン酸緩衝生理食塩水	ギブコ	10010-015
ROTI Histokitt(封入剤)	カール・ロス社 + Co.KG	6638.1
サルブタモール	テバGmbH
シベレスタット	ケイマンケミカルズ	17779
スプトリシン	カルバイオケム	560000-1セット
sSAM	社内で		2 mM

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