全血を用いた迅速な好中球走化性分析のためのマイクロ流体チップベースの方法

要約

出典:Yang, K., et al.一滴の血液から直接、好中球の高速走化性分析を行うオールオンチップ法です。J. Vis. Exp.(124), (2017年)

このビデオでは、オールオンチップ法を使用した好中球走化性アッセイを実演しています。この方法では、免疫磁気陰性選択とそれに続くマイクロ流体チップ上の走化性アッセイにより、全血から好中球を直接分離できます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. マイクロ流体デバイスの準備。

1. マイクロ流体細胞移動アッセイの調製
   バイオ
   1. セーフティキャビネット内で、ストックフィブロネクチン溶液50 μL(1 mg/mL)を950 μLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に希釈して、50 μg/mLのフィブロネクチン溶液を調製します。
   2. 9 mLのロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地(RPMI-1640)と1 mLのRPMI-1640を4%ウシ血清アルブミン(BSA)と混合して、移行培地を調製します。
   3. 脱イオン水をデバイスから取り出します。
   4. 100 μLのフィブロネクチン溶液をコンセントからデバイスに加えます。3分間待って、すべてのチャネルがフィブロネクチン溶液で満たされていることを確認します。マイクロ流体デバイスを蓋付きのペトリ皿に室温で1時間置きます。
   5. フィブロネクチン溶液をデバイスから取り出します。出口から100μLの移行培地を追加します。3分間待って、すべてのチャネルが移行媒体で満たされていることを確認します。
   6. 装置を室温でさらに1時間インキュベートし、その後、装置を走化性実験の準備が整います。
2. 走化性実験のための化学誘引剤溶液の調製。​
   1. 100 nM fMLP溶液を合計1 mLの移行培地に調製します。5 μL のストック FITC-デキストラン (10 kDa、1 mM) を fMLP 溶液と 1.5 mL チューブで混合します。
      手記：FITC-デキストランはグラジエント測定に使用されます。または、勾配インジケーターとして Rhodamine を使用します。その後、fMLP走化性溶液は走化性実験の準備が整いました。
3. 喀痰サンプルの準備。
   手記： COPD患者からの喀痰サンプルの勾配によって誘発される好中球走化性は、このオールオンチップ法の臨床診断アプリケーションとしてテストされました。
   1. COPD患者から喀痰サンプルを収集するための人間の倫理プロトコルを取得します.
      手記：ウィニペグのセブンオークス総合病院でサンプル採取の承認を取得しました(マニトバ大学承認)。
   2. すべての被験者から書面によるインフォームドコンセントフォームを入手します。
   3. COPD患者の自発的な喀痰サンプルを収集します。500 μLの喀痰サンプルを1.5 mLチューブに入れます。
   4. 1.5 mLチューブに500 μL 0.1%ジチオスレイトールを加え、穏やかに混合します。チューブを37°Cのウォーターバスに15分間入れます。
   5. サンプルを753 x gで10分間遠心分離し、上清を回収します。上清を865 x gで5分間遠心分離し、最終的な上清を回収します。採取した上清は、-80°Cの冷凍庫に保管してからご使用ください。
   6. 走化性実験の準備ができたら、喀痰溶液を解凍し、900 μLの移行培地を1.5 mLチューブに移し、バイオセーフティキャビネット内で100 μLの喀痰溶液と混合します。その後、喀痰溶液を走化性実験の準備が整います。
4. 血液サンプルの収集。
   1. 健康なドナーから血液サンプルを収集するための人間の倫理プロトコルを取得します。すべての献血者から書面によるインフォームドコンセントフォームを取得します.
      手記： ここでは、ウィニペグのビクトリア総合病院でサンプルが採取されました(マニトバ大学の合同教員研究倫理委員会によって承認されました)。
   2. 静脈穿刺で血液サンプルを採取し、サンプルをEDTAコーティングチューブに入れます。実験前にチューブをバイオセーフティキャビネットに保管してください。

2. All-on-chip Chemotaxis Assayの操作

1. オンチップセルアイソレーション(図1B)。
2. バイオセーフティキャビネット内の1.5mLチューブに全血10μLを入れます><。 手記： 血液サンプル採取の詳細については、セクション1.4を参照してください。
3. 好中球単離キット(材料の表を参照)から2 μLの抗体カクテル(Ab)と2 μLの磁性粒子(MP)を1.5 mLチューブに加え、穏やかに混合します。これにより、好中球を除く血液中の細胞が標識されます。
4. 血液-Ab-MP混合物を室温で5分間インキュベートします.
   手記： これにより、血液中の抗体標識細胞に磁気的にタグが付けられます。
5. デバイスのセルローディングポートの両側に 2 つの小さな磁気ディスクを取り付けます。デバイスのすべてのポートからメディアを吸引します。
6. 2 μL の血液-Ab-MP 混合物を細胞ローディングポートからマイクロ流体デバイスにゆっくりとピペットで移します。
   注:磁気的に標識された細胞は細胞ローディングポートの側壁に閉じ込められますが、好中球はデバイスに流れ込み、細胞のドッキング構造に閉じ込められます。
7. 十分な好中球が細胞ドッキングエリアに閉じ込められるまで数分待ちます。

3. 走化性アッセイ (図 1C)。

1. マイクロ流体デバイスを37°Cの温度制御された顕微鏡ステージに置きます。
2. 100 μL の走化性物質溶液 (fMLP またはスプタム溶液) と 100 μL の移動培地を 2 つのピペッターを使用して、指定された入口リザーバーに加えます。これにより、圧力バランス構造によって支援された連続的な層流ベースの化学混合により、グラジエントチャネルに化学誘引剤グラジエントが生成されます。
   手記：COPD患者からの喀痰収集の詳細は、セクション1.3にあります。
   1. 培地コントロール実験では、両方の入口リザーバーにのみ移行培地を追加します。
3. グラジエントチャネル内のFITC-Dextranの蛍光画像を取得します。
4. 「ファイル|開く」。
5. グラジエントチャネル全体の蛍光強度プロファイルを測定するには、コマンド「Analyze|プロットプロファイル」。
6. 測定データをスプレッドシートにエクスポートして、さらにプロットします。
7. 温度制御された顕微鏡ステージまたは従来の細胞培養インキュベーターでデバイスを15分間インキュベー
トします。
8. 10倍対物レンズを使用してグラジエントチャネルを画像化し、データ解析のために細胞の最終位置を記録します。
9. 必要に応じて、タイムラプス顕微鏡でデバイス内の細胞移動を記録します。

4. 細胞遊走データ解析(図1C)

1. 以下に説明するように、ドッキング構造からの細胞移動距離を計算することにより、走化性アッセイを分析します。図 1C を参照してください。
2. NIH ImageJソフトウェア(ver.1.45)に画像をインポートします。
3. グラデーションチャネルに移動した各セルの中心を選択します。
4. 選択したセルの最終的な位置の座標を測定します。ドッキング構造のエッジにある点の座標を初期参照位置として測定します。
5. 測定した座標データをスプレッドシートソフトウェア(Excelなど)にエクスポートします。セルの移動距離を、セルの最終位置と勾配方向に沿った初期参照位置との差として計算します。
6. 距離をマイクロメートルに校正します。走化性の尺度として、すべての細胞の移動距離の平均と偏差を計算します。
7. スチューデントのt検定を使用して、化学誘引剤勾配の存在下での移動距離を中型対照実験と比較します。
8. 細胞遊走のタイムラプス画像が記録されていれば、細胞追跡解析により細胞遊走性や走化性をさらに解析することができます
   手記：オールオンチップ走化性アッセイの構築と実施に必要な材料は、材料の表に詳述されています。

結果

図1:好中球走化性分析のためのオールオンチップ法の図。(A)マイクロ流体デバイスの図解。デバイスには 2 つのレイヤーが含まれています。最初の層(高さ4 μm)は、グラジエントチャネルのそばに細胞をトラップするための細胞ドッキングバリアチャネルを定義します。2番目の層(高さ60μm)は、グラジエント生成チャネル、セルローディング用のポートとチャネル、化学物質の入口リザーバー、および廃棄物の出口を定義します。整列マークは、2 つのレイヤー用に設計されています。2番目の層では、上流の蛇行入力チャネルの長さと幅はそれぞれ60mmと200μmです。下流の蛇行入力チャネルの長さと幅は、それぞれ6mmと280μmです。(B)オールオンチップセル分離法の図解。(C)走化性試験の図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
デバイス製造
マスクアライナー	ABMの	該当なし
紡績工	ソリテック	5000
ホットプレート	VWRの	〒11301-022
プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	PDC-001
真空デシケーター	フィッシャーサイエンティフィック	08-594-15A
SU-8 2000 シンナー	マイクロケム	SU-8 2000
SU-8 2025 フォトレジスト	マイクロケム	SU-8 2025
(トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル)トリクロロシラン	ゲレスト	78560-45-9
Siウェーハ	シリコン株式会社	LG2065
スライドガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-544-4
カッティングパッド	該当なし	該当なし	オーダーメイド
パンチャー
オンチップ細胞単離および走化性アッセイ
RPMIの1640	フィッシャーサイエンティフィック	SH3025502
DPBSの	フィッシャーサイエンティフィック	SH3002802
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	SH3057402
フィブロネクチン	VWRの	CACB356008
fMLPの	シグマ・アルドリッチ	F3506-10MG
磁気ディスク	インディゴインスツルメンツ	44202-1	直径5mm、厚さ1mm
FITC-デキストラン	シグマ・アルドリッチ	FD10Sの
ローダミン	シグマ・アルドリッチ	R4127-5G
ギムザ染色液	ローリー・バイオケミカル・インク	G-472-1-8OZの
EasySep Direct ヒト好中球単離キット	STEMCELL Technologies株式会社	19666年
ジチオスレイトール	シグマ・アルドリッチ	D0632
ニコンTi-U倒立蛍光顕微鏡	ニコン	Ti-U
顕微鏡環境チャンバー。	InVivo サイエンティフィック	該当なし
CCDカメラ	ニコン	DS-FI1