がん細胞に対する事前活性化CD8+ T細胞の細胞毒性を研究するためのIn vitroアッセイ

要約

出典:Kitamura, T., et al. Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8⁺ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-inposttrating Myeloid Cells. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオでは、事前に活性化されたエフェクターT細胞によって誘導された癌細胞のアポトーシスアッセイを紹介しています。これらの細胞を蛍光核でマークされたがん細胞と共培養することにより、カスパーゼ切断可能な蛍光基質が添加されます。アポトーシスがん細胞は、核内で異なる色を示し、二重の蛍光を発します。この二重蛍光は、がん細胞がアポトーシスを受けていることを示しています。

プロトコル

1. 核内に赤色蛍光タンパク質を発現する標的細胞の作製

1. 適切な供給元から標的マウス癌細胞株を入手してください.
   手記：このプロトコルでは、E0771マウス乳腺腫瘍細胞(E0771-LG)の高転移性誘導体が使用されます。親E0771細胞はC57BL/6マウスに由来します。
2. E0771-LG細胞のバイアルを、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコのModified Eagles Medium(DMEM)で37°C、湿度95%、5%CO₂.
   の細胞培養インキュベーターで解凍し、維持します 手記：細胞がマイコプラズマに対して陰性であることを確認すべきである。この目的のために、上記のようにE0771細胞(または試験対象の細胞)を2〜3日間(抗生物質および抗真菌薬がない場合)培養し、500μLの培地を回収する。培地を12,419 x gで60秒間遠心分離して細胞の破片を除去し、上清を新しいチューブに移します。市販のマイコプラズマ検査キット(材料表を参照)および/またはメーカーの指示に従ってPCRを使用して、マイコプラズマ汚染を測定します。
3. ウェルあたり5 x 10³ E0771-LG細胞を12ウェルプレートに播種し、10%(v/v)FBS-DMEMで細胞をインキュベーターで一晩培養し、37°C、湿度95%、_CO2.
   手記：標的細胞の増殖速度が低い場合(集団倍加時間が36時間を超える場合)、細胞数を1×10⁴に増やすことができる。
4. 培地を 10 μg/mL ポリブレンを含む 10% (v/v) FBS-DMEM 1 mL と交換し、核制限赤色蛍光タンパク質 (mKate2、材料表を参照) をコードする 25 μL のレンチウイルス粒子 (1 x 10⁶ TU/mL) を加えます。
5. 細胞をインキュベーターで37°C、湿度95%、_CO25%で24時間培養します。
6. 培地を10%(v / v)FBS-DMEMと交換し、インキュベーターで37°C、湿度95%、_CO25%のインキュベーターで24〜48時間細胞を培養します。
7. 細胞が赤色蛍光タンパク質を発現し始めたら、培地を10%(v / v)FBS-DMEMに1μg / mLピューロマイシンを含めて交換し、細胞が80〜90%コンフルエントになるまで培養します
   手記：ピューロマイシンの濃度は標的細胞の種類によって異なるため、トランスフェクションされていない細胞を使用して最適化する必要があります。
8. 1 μg/mLピューロマイシンを含む10%(v/v)FBS-DMEMで生存細胞を1〜3継代で継代し、液体窒素気相保存システムでストックを凍結保存するまで使用します。

2. マウスの腫瘍からのサプレッサー細胞の単離

>注:このプロトコルでは、サプレッサー細胞(すなわち、転移関連マクロファージ(MAM)および単球性骨髄由来サプレッサー細胞(M-MDSC))は、E0771-LG細胞によって確立された転移性腫瘍を含む肺から単離されます。組織の解離と細胞選別の条件を最適化して、異なる組織から細胞を単離する必要があります。

1. 1 x 10⁶がん細胞(E0771-LG)を同系(C57BL / 6)、雌、7〜10週齢マウスの尾静脈に注入します。
2. 14日後、転移性腫瘍を含む肺を分離し、前述のように酵素消化を介して灌流した肺から単一細胞懸 ?? 液を調製します
   手記：このプロトコルでは、4匹のマウスに癌細胞を注入し、それらの転移性肺を組み合わせて十分なサプレッサー細胞を得る。
3. シングルセル懸濁液を抗マウスCD16/CD32抗体と氷上で30分間インキュベートし、CD45、F4/80、CD11b、Ly6C、およびLy6Gに対する蛍光抗体(材料表を参照)でさらに30分間染色します。
4. 染色した細胞を2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を含むPBS1 mLで1回洗浄し、2%(w/v)BSAを含むPBS500〜1000μLで細胞ペレットを再懸濁します。
5. 3 μM の DAPI を添加し、M-MDSC (^DAPI–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^高Ly6C^高) と MAM (^DAPI–CD45⁺F4/80⁺Ly6G^–CD11b^高Ly6C^低) をセルソーター (図 1) を使用してソーティングします (図 1)
   手記： MAM(Ly6Clow)とM-MDSC(Ly6Chigh)を区別するためのLy6Cレベルの閾値は、常在歯胞マクロファージ(RMAC)の閾値に基づいています。選別された細胞の純度は、フローサイトメトリーによって測定され、期待される純度は90%を超えます。
6. 20% (v/v) FBS、1% (v/v) ペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、1% (v/v) 非必須アミノ酸、1 mM ピルビン酸ナトリウム、および 50 nM 2-メルカプトエタノール (enriched-DMEM、E-DMEM) を含む 400 μL の DMEM で、選別した細胞を再懸濁します。
7. トリパンブルー排除法を使用して生細胞の数をカウントし、E-DMEMで2 x 10⁶細胞/mLに調整します。
8. 使用するまで細胞を氷の上に置いてください。

3. マウスの脾臓からのCD8⁺ T細胞の単離

1. 標的がん細胞株と同系のマウス(すなわち、このプロトコルではC57BL/6マウス)から脾臓を次のように分離します。
   1. CO₂吸入により動物を安楽死させます。
   2. 動物を清潔な解剖ボードに置き、70%(v / v)エタノールで皮膚を拭きます。
   3. ハサミで腹部の皮膚を切って脾臓を露出させます
   4. 胃より下に位置する脾臓を分離し、5mLの氷冷PBSを含むチューブに入れます。
2. 滅菌済みの5 mLシリンジのインナープランジャーを使用して、50 mLチューブにセットされた100 μmセルストレーナーで脾臓を粉砕します。
3. 合計10 mLのPBSを使用して細胞をフィルターに通します。
4. 細胞懸濁液を337 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
5. 2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)と0.5%(w / v)BSA(ランニングバッファー)を含むPBS1 mLにセルペレットを再懸濁し、40 μmセルストレーナーでろ過します。
6. 生細胞数をカウントし、ランニングバッファーを使用して1 x 10⁸細胞/mLに調整します
   手記： 純度チェックのための濃縮前サンプルとして、細胞の少量アリコートを保管してください。
7. CD8⁺ T細胞の濃縮には、ネガティブセレクションキットと磁気選別機を使用します(材料表を参照)。
   1. 脾細胞の1 x 10⁸(1 mL)を5 mLポリスチレン丸底チューブに移します。
   2. 50 μLのビオチン化抗体を添加し、室温で10分間インキュベー
   トします。
   3. 125 μLのストレプトアビジン標識磁気ビーズを添加し、室温で5分間インキュベー
   トします。
   4. 1.325 mLのランニングバッファーを加え、ピペッティングで穏やかに混合します。
   5. チューブを磁石に入れ、室温で2.5分間インキュベートします。
   6. 磁石を手に取り、濃縮された細胞懸濁液を新しいチューブに注ぎます。
8. 濃縮した細胞を200 μLのE-DMEM(すなわち、20%(v/v)FBS、1%(v/v)ペニシリン/ストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、1%(v/v)非必須アミノ酸、1 mMピルビン酸ナトリウム、および50 nM 2-メルカプトエタノールを含むDMEM)で再懸濁します。
9. 生細胞の数をカウントし、E-DMEMで2 x 10⁶細胞/mLに調整します。使用するまで、細胞を_CO2インキュベーターで37°Cに保ちます.
   手記：純度チェックのための濃縮後のサンプルとして、細胞の少量のアリコートを保管してください。
10. CD8⁺ T細胞の純度をフローサイトメトリーにより以下のように測定します。
    1. 濃縮前(ステップ3.6)または濃縮後(ステップ3.9)のサンプルから1 x 10⁴細胞を採取し、ランニングバッファーを使用して各細胞の合計容量を100 μLに調整します。
    2. シングルセル懸濁液を抗マウスCD16/CD32抗体と氷上で30分間インキュベートし、CD45、CD3、CD4、およびCD8に対する蛍光抗体(材料表を参照)でさらに30分間染色します(材料表を参照)。
    3. 染色した細胞を2%(w/v)BSAを含む500μLのPBSで洗浄し、細胞ペレットを2%(w/v)BSAを含む500〜1000μLのPBSで再懸濁します。
11. 3 μMの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を添加し、全CD45⁺細胞集団に占めるCD3^+CD4-CD8+細胞の割合を決定します。

4. 単離されたCD8⁺ T細胞の活性化と増殖

1. 50 μL CD8⁺ T細胞(ステップ3.9で調製)あたり1 x 10⁵細胞をU底96ウェルプレートのウェルに分注します。
2. 50 μLのサプレッサー細胞(ステップ2.7で調製)または50 μLのE-DMEMにつき1 x 10⁵細胞をウェルに加えます。
3. E-DMEM、4 x 10⁴ U/mLコロニー刺激因子1(CSF-1)、240 U/mLインターロイキン-2(IL-2)、8 μg/mL抗マウスCD3ε抗体、および16 μg/mL抗マウスCD28抗体からなる活性化培地を調製します
   手記： CSF-1はT細胞の活性化には必要ありませんが、このプロトコルのサプレッサー細胞(すなわち、MAMおよびM-MDSC)の生存に不可欠です。したがって、T細胞と標的がん細胞との共培養に保持され、培養条件の一貫性が維持されます。CSF-1はすべての組織にナノモル濃度で見られ、in vivoでの単球/マクロファージの生存率に必要であるため、これはこれらの細胞の生理学的状況です。
4. 50 μLの活性化培地(ステップ4.3)と、試験する試薬の有無にかかわらず、50 μLのE-DMEMを添加します。
5. プレートを37°C、湿度95%、_CO25%のインキュベーターに入れ、細胞を4日間培養します。

5. 活性化済みCD8⁺ T細胞と標的細胞の共培養のセットアップ

1. 顕微鏡観察に適した平底96ウェルプレートのウェルに、1:100希釈した成長因子還元可溶性基底膜マトリックス(材料表)30 μLを加え、CO₂インキュベーターで37°Cで少なくとも1時間インキュベー
トします。
2. 標的細胞(すなわち、核制限赤色蛍光タンパク質を発現するE0771-LG細胞)を調製します。
   1. 標的細胞を0.05%トリプシン/EDTA1 mLと室温で1分間インキュベートし、穏やかなピペッティングで細胞を回収します。
   2. 10%(v/v)FBSを含むDMEM9 mLを添加し、細胞懸濁液を337 x gで5分間遠心分離します。
   3. 500 μL の E-DMEM で細胞を再懸濁し、生細胞の数をカウントします
      手記： 標的細胞をカウントする前に、40μmのセルストレーナーで細胞をろ過し、単一細胞懸濁液を作製します。
   4. E-DMEMを添加して密度を2 x 10⁴細胞/mL(= 1 x 10³細胞/50 μL)に調整し、細胞を氷上に保ちます。
3. エフェクター細胞(すなわち、事前に活性化されたCD8⁺ T細胞)を調製します。
   1. ピペッティングにより、細胞を96ウェルプレートのウェルに再懸濁し(ステップ4.5)、浮遊CD8⁺ T細胞を新しい1.5mLチューブに移します><。 手記：MAMおよびM-MDSCはウェルにしっかりと接着し、ピペッティングによって剥離しません。
   2. 残りの細胞を回収するには、ステップ5.3.1で200μLのPBSをウェルに加え、チューブに移します。
   3. 細胞を1mLのE-DMEMで1回洗浄(337 x gで遠心分離)し、上清を吸引して廃棄します)、100 μLのE-DMEMで再懸濁します。
   4. 生細胞の数をカウントし(トリパンブルー排除法を使用)、密度を1.6 x 105 cells/mL(= 4 x 10³ cells/25 μL)に調整し、細胞を氷上に保ちます。
4. ステップ5.1でプレートの各ウェルから基底膜マトリックスを吸引します。
5. 1 x 10³細胞/50 μLのターゲット細胞(ステップ5.2.4)を各ウェルに加え、well.
   手記： 媒体の蒸発によるエッジ効果を避けるために、96ウェルプレートの内側の60ウェルのみを分析に使用する必要があります。
6. 4 x 10³ U/mL IL-2 および 10 μM 蛍光カスパーゼ-3 基質を含む 25 μL の E-DMEM を添加します (材料表を参照)。
7. 4 x 10³細胞/25 μL の CD8⁺ T 細胞 (ステップ 5.3.4) を適切なウェルに加え、よく混合します
   手記： ウェル内に細胞が多すぎると、分析が難しくなります。このモデルでは、4:1のエフェクター:ターゲット比(総細胞数5 x 10³細胞/ウェル)が最適でしたが、8:1の比率は最適ではありませんでした。データ解析を支援するには、次の4つのコントロールを含むウェルが必要です:カスパーゼ-3基質の有無にかかわらず培地中の共培養ウェル(1 x 10³細胞/ウェル)に使用した密度のターゲット細胞、カスパーゼ-3基質の有無にかかわらず培地中のエフェクター細胞(1 x 10³細胞/ウェル)。
8. 200 μLのPBSまたは滅菌水をすべての空のウェル(特にプレートの周囲のウェル)に追加して、実験ウェルからの培地の蒸発を減らします。
9. プレートを、37°C、湿度95%、_CO5%に維持されるタイムラプス蛍光顕微鏡にセットします。2.
   手記：プレートを交差パターンで振ってすべての細胞を均等に分散させ、プレートを平らな面に室温で10〜20分間放置してから、インキュベーターに移します。

6. 細胞のイメージング

>注:詳細な画像取得設定は、使用する顕微鏡と蛍光色素によって異なります。最適な結果を得るには、次の一般的な取得パラメータを使用する必要があります。

1. 顕微鏡で適切なオートフォーカスルーチンを使用して、96ウェルプレートの各実験ウェルの総表面積の少なくとも25%をカバーする画像を取得します。
2. 位相差のある画像を取得するように顕微鏡を設定し、核制限された赤色蛍光タンパク質(mKate2)に適した蛍光チャンネルと、緑色の蛍光活性活性カスパーゼ-3基質(488 nmで励起)に適した蛍光チャンネルを設定します(図2)。
3. 実験用ウェルで位相コントラストと2つの蛍光チャンネルを1〜3時間ごとに少なくとも72時間撮影します。

結果

図 1.転移性肺からサプレッサー細胞を単離するためのゲーティング戦略。(A)単球性骨髄由来サプレッサー細胞(M-MDSC)および転移関連マクロファージ(MAM)を単離するための代表的なドットプロット。MAM(Ly6C^低)とM-MDSC(Ly6C^高)を区別するためのLy6Cレベルの閾値は、常在歯胞マクロファージ(RMAC)の閾値に基づいています。(B)選別されたM-MDSC(CD45⁺Ly6G-CD11b⁺Ly6C^高)およびMAM(CD45⁺Ly6G-CD11b⁺Ly6C^低)の純度。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.05% トリプシン EDTA (1X)	ギブコ	〒25300-054
12ウェル細胞培養プレート	フレイナーバイオワン	665-180
1x PBSの	ギブコ	14190から094
2-メルカプテノール	シグマ	M6250-10ミリリットル
5mLプリスチレン丸底チューブ	隼	352054
96ウェル細胞培養プレート(丸底)	共演者	3799	CD8+T細胞と選別骨髄細胞の共培養
96ウェルプレート(平底)	ヌンク	165305	細胞毒性アッセイのためのCD8+T細胞と標的細胞の共培養
AF647 anti-mouse F4/80	バイオラッド	MCA497A647	クローン:CIA3-1、Lot#:1707、2 μL/1x10^6 細胞
AlexaFluor700 抗マウス CD8 抗体	バイオレジェンド	100730	クローン:53-6.7、Lot#:B205738、0.5 μL/1x10^6細胞
抗マウス CD28 抗体	バイオレジェンド	102111	単離されたCD8+ T細胞の活性化、クローン:37.51、ロット#:B256340
抗マウス CD3e 抗体	バイオレジェンド	100314	Activation of isolated CD8+ T cells, Clone: 145-2C11, Lot#: B233720
APC 抗マウス CD3 抗体	バイオレジェンド	100236	クローン:17A2、Lot#:B198730、0.5 μL/1x10^6 細胞
APC/Cy7 抗マウス Ly6C 抗体	バイオレジェンド	128026	クローン:HK1.4、Lot#:B248351、1 μL/1x10^6細胞
ウシ血清アルブミン	シグマ	A1470-100Gの
セルストレーナー(100μmナイロン)	隼	352360	脾臓を粉砕するために
セルストレーナー(40μmナイロン)	隼	352340	肺の消化をろ過するには
ダピ	バイオレジェンド	422801
ダルベッコ修正イーグルミディア	ギブコ	41966から029
EasySepマウスCD8+ T細胞単離キット	StemCellテクノロジー	19853
ウシ胎児血清	ギブコ	10270-106
FITC 抗マウス CD4 抗体	バイオレジェンド	100406	クローン:GK1.5、Lot#:B179194、0.5 μL/1x10^6細胞
Geltrex Ready-to-Use(すぐに使える	ギブコ	A1596-01	細胞毒性アッセイのための96ウェルプレートのコーティング
IncuCyte NucLight Red レンチウイルス試薬	エッセンバイオサイエンス	4476	mKate2をコードするLentiウイルス分物
インキュサイトZOOM	エッセンバイオサイエンス		検出器(蛍光顕微鏡)
IncuCyte ZOOM 2018A	エッセンバイオサイエンス		解析ソフトウェア
L-グルタミン (100X)	ギブコ	A2916801
肺解離キット	ミルテニー	〒130-095-927	担がん肺からの単一細胞懸濁液の調製
MycoAlert マイコプラズマ検出キット	ロンザ	LT07-318
非必須アミノ酸 (100X)	ギブコ	11140-035
NucView488	ビオチウム	10403	蛍光性カスパーゼ-3基質
PE 抗マウス Ly6G 抗体	バイオレジェンド	127607	クローン:1A8、Lot#:B258704、0.5 μL/1x10^6細胞
PE/Cy7 抗マウス CD11b 抗体	バイオレジェンド	101216	クローン:M1/70、Lot#:B249268、0.5 μL/1x10^6細胞
ペン連鎖球菌	ギブコ	15140-122	ペニシリンストレプトマイシン細胞の初代培養用
PerCP/Cy5.5 抗マウス CD45 抗体	バイオレジェンド	103132	クローン:30-F11、ロット#:B249564、0.5 μL/1x10^6細胞
ポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)	シグマ	H9268-J
ピューロマイシン	ギブコ	A11138-03 (日本語版)
RBC 溶解バッファー (10X)	バイオレジェンド	420301
組換えマウスIL-2	ペプロテック	212から12	単離されたCD8+ T細胞の活性化
ピルビン酸ナトリウム(100X)	ギブコ	11360-070
TruStain fcX (抗マウス CD16/32) 抗体	バイオレジェンド	101320

名 抗体 ム 年 ) 名 の