マクロファージにおける複数のカスパーゼの活性化の評価

要約

出典:Han, J. et al., 自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価。J. Vis. Exp.(2023年度)

このビデオは、インフルエンザウイルスによる刺激による骨髄由来マクロファージの複数のカスパーゼ活性化の評価を示しています。マクロファージ溶解、ライセートの熱不活性化、および遠心分離に続いて、細胞内カスパーゼを回収し、その後の免疫学的分析を行います。

プロトコル

1. 解決策の準備

1. L929 でコンディショニングされたメディアを準備します。
   1. 50 mLのL929培地を含む182 cm²組織培養フラスコに、プレート1 × 10^{6 L929}細胞(材料の表を参照)を入れます(培地の調製については表1を参照)。
   2. 加湿インキュベーターで37°C、5%二酸化炭素、CO₂で細胞を増殖させます。
   3. 7日後、上清を回収し、0.45μmフィルターでろ過します。50 mLのアリコートを調製します(冷凍アリコートは-80°Cで最大1年間保存します)。
2. 骨髄由来マクロファージ(BMDM)培養培地500 mLを調製します(表1)。
3. 500 mLのBMDM刺激培地を調製します(表1)。
4. 感染用の培地500 mLを調製します(表1)。
5. 100 mLの1 M Trisバッファーを調製します(表1)。
6. 4xドデシル硫酸ナトリウム(SDS)バッファーを調製します(表1)。
7. 1 mLの1 M 1,4-ジチオスレイトールを調製します(DTT、表1)。
8. 40 mLのカスパーゼ溶解バッファーを調製します(表1)。
9. 1.5 M Trisバッファー100 mLを調製します(表1)。
10. 100 mL の 10% (wt/vol) SDS 溶液を調製します (表 1)。
11. 2x radioimmunoprecipitation assay(RIPA)バッファー(表 1)を 50 mL 調製します。
12. 5 mg/mL リポ多糖 LPS 溶液を調製します(表 1)。
13. 0.5 M アデノシン三リン酸 ATP 溶液を調製します(表 1)。
14. ウェスタンブロッティング溶液を調製します。
    1. 5xランニングバッファーストック1Lを調製します(表1)。
    2. 10xトランスファーバッファーストック1Lを調製します(表1)。
    3. Tween 20 で 1 L のトリス緩衝生理食塩水を調製します (TBST、表 1)。
    4. 5%(wt/vol)脱脂乳ブロッキング溶液100 mLを調製します(表1)。
15. 一次抗体溶液を調製します。
    1. 10 mLのカスパーゼ-1一次抗体を調製します(表1)。
    2. 10 mLのカスパーゼ-11一次抗体を調製します(表1)。
    3. 10 mLのカスパーゼ-3一次抗体を調製します(表1)。
    4. 10 mLのカスパーゼ-7一次抗体を調製します(表1)。
    5. 10 mLのカスパーゼ-8一次抗体を調製します(表1)。
    6. 10 mLのカスパーゼ-9一次抗体を調製します(表1)。
    7. HRP標識β-アクチン一次抗体10 mLを調製します(表1)。
16. 二次抗体溶液を調製します。
    1. 10 mLの抗ウサギ二次抗体を調製します(表1)。
    2. 10 mLの抗マウス二次抗体を調製します(表1)。
    3. 10 mLの抗ラット二次抗体を調製します(表1)。

2. 骨髄由来マクロファージの単離

>注:このプロトコルでは、プログラム細胞死(PCD)経路が無傷の6〜10週齢の野生型マウス、またはPCDレギュレーター、エフェクター、または目的の分子が削除または変更された変異マウスを使用できます。

1. CO2チャンバー内でマウスを安楽死させ、1分間にケージ容積の10%〜30%を2〜3分間変位させる流量でマウスを安楽死させます。次に、子宮頸部脱臼などの二次安楽死法を実行します。該当する場合は、施設、機関、および政府固有の追加のガイドラインと規制に従ってください。
2. マウスを解剖して、後肢の骨を回収します。
   1. マウスを背中に固定して、腹部が露出するようにします。70%(vol / vol)エタノールをスプレーして、後肢と腹部を滅菌します。
      注意：エタノールは可燃性です。直火から遠ざけてください。
   2. ハサミを使って腹部の正中線を切開し、大腿骨が見えるように脚に向かって切り続けます。
   3. 右後脚を取り、皮膚を体から正中線に向かって引き離します。内転筋を正中線に向かって切断することにより、脚を体から切り離します。次に、股関節と背骨の間の脚を切断します。次に、足首の遠位部を切り取り、皮膚を剥がし、少し開いたハサミでふくらはぎの組織を剥がすことで、骨から余分な組織を取り除きます。
   4. 70%(vol / vol)エタノールに浸したタオルの上に脚を置き、脛骨と大腿骨を解剖します。.
      1. 脛骨と大腿骨をそれぞれ別々の鉗子のセットで留めます。脛骨を膝関節の自然な方向にそっと押し付けます。これにより、膝で脛骨が折れます。
      2. 必要に応じて、鉗子と解剖はさみを使用して、残っている吊り下げ組織を取り除きます。脛骨は、エタノールを染み込ませたタオルの上に置いて、後で使用するために保存してください。
      3. 膝を折って、同じ方法で大腿骨を集めます。
   5. 上記の手順3と4を左脚で繰り返して、左脚を体から取り外し、脛骨と大腿骨を解剖します。
   6. 骨に70%(vol / vol)エタノールをスプレーします。
   7. エタノールを染み込ませた70%(vol/vol)の清潔なタオルの上に骨を置き、タオルの肉質部分を絞って骨を絞り、タオルを骨にこすりつけて余分な組織を取り除きます。
3. 両方の大腿骨と両方の脛骨がきれいになったら、4つの骨すべてに70%(vol / vol)エタノールをスプレーします。滅菌ペトリ皿に骨を集め、皿内の培地を静かに振って、10mLのBMDM培養培地ですすいでください。
4. 10 mLシリンジに10 mLの新鮮なBMDM培養培地を充填し、25 Gの針を取り付けます。
5. 鉗子を使用して脛骨を拾い上げ、足首の関節を~45°の角度で切断します。
6. 脛骨から骨髄を洗い流します。
   1. 脛骨の狭い方の端を下に向けて、脛骨を50mLのチューブにかざします。充填されたシリンジから脛骨の上にメディアを分注します。.
   2. 骨髄の上端に針を(最初は穏やかに)挿入し、メディアを分注します。
   3. 針を取り外してから、再度挿入します。短く高圧プッシュを使用してメディアを分注し、針を骨髄に移動します。
   4. 培地が骨の底から流れ出始めたら、短く高圧のプッシュを使用して細胞を洗い流し続けます。このプロセスでは、ボーンの色を監視し、ボーンが白い場合は破棄します。
   5. 両方の脛骨に対してこれを行います。
7. 大腿骨について上記の手順5と6を繰り返し、脛骨が足首関節で切断されたように股関節を切断します。骨髄を洗い流すのと同じ50 mLチューブを使用してBMDM培地を回収します。
8. 4つの骨すべてが洗い流されたら、10mLシリンジで18Gの針を使って50mLチューブの骨髄と培地を上下に3回吸引し、毎回チューブの側面をすすぎ、骨髄を分散させます。
9. BMDM培地を使用して、50 mLチューブ内の最終容量を30 mLに調整し、細胞が完全に懸濁されていることを確認します。
10. 70 μmセルストレーナーを使用して、50 mLチューブからBMDM培養培地をろ過します。
11. 得られた細胞懸濁液(骨髄前駆細胞を含む)を、それぞれに10 mL(または~20 × 10⁶細胞)を加えて、3つの150 mm組織培養皿にプレートします。次に、各皿にさらに10 mLのBMDM培地を加えます。加湿インキュベーターで37°Cでインキュベートします。

3. 実験のためのBMDMとめっきの区別

1. メッキした骨髄前駆細胞を37°Cで3日間インキュベートします。次に、各ディッシュを取り出し、さらに5〜8 mLのBMDM培地を追加します(表1)。37°Cでインキュベーターに戻します。
2. 最初のプレーティング後5日目に、各ディッシュを取り出し、さらに5 mLのBMDM培地を追加します。37°Cでインキュベーターに戻します。
3. 6日目に、各皿を取り外し、メディアを廃棄します。次に、10 mLの冷(4°Cで保存)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて1回洗浄します。10mLの冷たいPBSウォッシュを廃棄します。次に、各皿に10 mLの新鮮で冷たいPBSを加え、各皿を氷の上で5分間インキュベートします。
4. セルスクレーパーを使用して、3つのディッシュすべての細胞を1本の50 mLチューブに優しく掻き取ります。細胞を270 × g、4°Cで5分間穏やかにスピンダウンします。次に、上清を捨てます。
5. 20 mLのBMDM培養培地を添加し、ピペットで上下させてペレットを再懸濁し、細胞をカウントします。
   手記：各マウスは、約60×10⁶〜100×10⁶細胞を産出することが期待されます。
6. 目的のin vitro細胞死/炎症刺激アッセイのための12ウェルプレートレイアウトを計画します。ウェルごとに1個×10個の⁶個の細胞をプレートするように計画します。計画された各刺激について、少なくとも3つの生物学的複製を含め、カスパーゼ溶解バッファーで回収するウェルの1セットとRIPAバッファーで回収するウェルの2セットをプレート化します。
7. プレート1 × 12ウェルプレートのウェルあたり1 mLのBMDM培養培地に10⁶個の細胞を入れます。加湿インキュベーターで37°Cで一晩培養した後、細胞死/炎症の評価に進みます。一晩インキュベートした後、培地を取り出し、各ウェルに1 mLの温かい(37°C)PBSを加えて細胞を洗浄します。
8. PBS洗浄液を取り出し、抗生物質を含むBMDM刺激培地500μL(非細菌刺激を行う場合)または抗生物質を含まないBMDM刺激培地(細菌刺激を行う場合)を加えます(表1)。2時間インキュベートしてから、in vitro刺激/感染のステップ4に進みます。

4. 細胞を刺激または感染させる

>注意:このプロトコルに含まれる薬剤は潜在的に病原性であり、関連する機関および政府当局からの承認を得て、バイオセーフティレベル2(BSL2)施設で適切な予防措置を講じて取り扱う必要があります。

1. BMDMを刺激して、興味のあるトリガーで細胞死を活性化します。
   手記：このプロトコルの目的上、インフルエンザA型ウイルス(IAV)、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)、フランシセラ・ノビシダ、およびLPS+ATPが説明のために使用されるが、他のトリガーを使用することができる。
   1. 刺激例1:IAV(A /プエルトリコ/ 8/34、H1N1 [PR8])に感染します(Hoffmann et al.による構築;感染の多様性[MOI]決定のウイルス力価は、MDCK細胞のプラークアッセイによって計算されます)。
      1. 式 (1) と式 (2) を使用して、20 プラーク形成単位 (PFU) の感染多重度 (MOI) で感染に必要なウイルスの量を計算します
         
         
         
   2. BMDMから培地を取り出し、500μLのPBSで細胞を一度洗浄します。加熱不活化ウシ胎児血清(HI)-FBSを含まない高グルコースDMEM中の450μLのIAV(20MOI)を各ウェルに加えます。プレートを加湿インキュベーターで37°Cで1時間インキュベートし、吸収させます。
   3. プレートを取り外し、HI-FBSを50μL加えます。プレートを37°Cのインキュベーターに戻し、合計12時間インキュベー
   トします。

>5. カスパーゼウェスタンブロットに使用する上清とタンパク質溶解物の組み合わせを採取します。

1. 4時間、12時間、または16時間のインキュベーション後(特定のタイミングは使用するトリガーによって異なります)、プレートをインキュベーターから取り外します。
2. 上清150 μLを取り除き、これを廃棄するか、他の上清分析(酵素結合免疫吸着アッセイ[ELISA]など)のために保存してください。残りの上清を取り除かないでください。
3. ウェルあたり50 μLのカスパーゼ溶解バッファー + 100 μL の4x SDSバッファーを組み合わせて、タンパク質回収溶液を調製します(表1)。次に、各ウェルに150 μLの混合物を加えます。
4. ウェルごとに、混合物をピペットで上下に動かし、溶解した細胞と上清を収集します。ピペッティング中に、ピペットチップでウェルの底をこすり落とし、細胞を破壊します。スクレイピングとピペッティングの後、タンパク質ライセートを標識された1.5 mLチューブに回収します。
5. ヒートブロックを使用して、すべてのチューブを100°Cに12分間加熱します。
6. 不溶性成分は、室温で14,500 × gで30秒間遠心分離することにより、ペレット化します
   注:これは一時停止ポイントです - 結合した上清とタンパク質溶解物からのタンパク質は、すぐに使用するか、または-20°Cで最大2ヶ月間、または-80°Cで最大6ヶ月間保存することができます。

カテゴリ	試薬	準備	備考	安全上のご注意
メディア	L929培地	1)FBSを熱停止します(備考参照). 2) 43.5 mLのIscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM)、5 mLの熱不活化ウシ胎児血清(HI-FBS)、0.5 mLのピルビン酸ナトリウム、0.5 mLの非必須アミノ酸、0.5 mLのペニシリンとストレプトマイシンを組み合わせます。	FBSを56°Cで30分間インキュベートすることにより、加熱不活化します。
	骨髄由来マクロファージ(BMDM)培地	290 mLのIMDM、150 mLのL929コンディショニング培地、5 mLの非必須アミノ酸、50 mLのHI-FBS、5 mLのペニシリンとストレプトマイシンを組み合わせます。	使用前に、培地を水またはビーズ浴で37°Cに温めてください。培地は4°Cで最大1週間保存できます。
	抗生物質を含むBMDM刺激媒体	445 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)、50 mLのHI-FBS、および5 mLのペニシリンとストレプトマイシンを組み合わせます。.	使用前に、培地を水またはビーズ浴で37°Cに温めてください。培地は4°Cで最大1週間保存できます。
	抗生物質を含まないBMDM刺激媒体	450 mLのDMEMと50 mLのHI-FBSを組み合わせます。	使用前に、培地を水またはビーズ浴で37°Cに温めてください。培地は4°Cで最大1週間保存できます。
	感染用培地(HI-FBSなし)	495 mLの高グルコースDMEMと5 mLのペニシリンおよびストレプトマイシンを組み合わせます。.	使用前に、培地を水またはビーズ浴で37°Cに温めてください。培地は4°Cで最大1週間保存できます。
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)バッファー	1 M トリスバッファ (4x SDSバッファ用)	1) トリス12.11gを脱イオン水80mLに溶解します 2)攪拌しながらHClを一滴加えてpHを6.8に調整します. 3)脱イオン水を加えて、最終容量を100mLに調整します。	バッファーは4°Cで最大1ヶ月間保存できます。	HClは腐食性です。常に適切な個人用保護具を着用してください。これには、白衣と手袋が含まれます。HClはドラフトで取り扱う必要があります。
	4x SDSバッファ	1)1 M Tris(pH 6.8)溶液60 mL、SDS24 mg、ブロモフェノールブルー100 mg、グリセロール120 mL、β-メルカプトエタノール(BME)8.4 mL、脱イオン水90 mLを混合します。2)加温攪拌板で攪拌し、塩分が溶液に入るようにします。3) 脱イオン水を加えて、最終容量を300mLに調整します。	バッファーは分注し、-20°Cで最大1年間保存できます。	SDSは腐食性であり、BMEは発がん性があります。常に適切な個人用保護具を着用してください。これには、白衣と手袋が含まれます。SDSとBMEはドラフトで取り扱ってください。
カスパーゼ溶解バッファ	1 M 1,4-ジチオスレイトール(DTT)	0.154 gのDTT粉末を1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解します。DTT をソリューションに組み込むことができます。	バッファーは200μLのアリコートに分注し、-20°Cで最大1年間保存できます。
	カスパーゼ溶解バッファー	35 mLの脱イオン水、4 mLのNP-40、750 μLの1 M DTT、1つのプロテアーゼ阻害剤錠剤、および1つのホスファターゼ阻害剤錠剤を組み合わせます。	バッファーは4°Cで最大1ヶ月間保存できます。
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) バッファー	1.5 M トリスバッファ (RIPAバッファ用)	1) 18.2 g の Tris を 80 mL の脱イオン水に溶解します><。 2)攪拌しながらNaOHを一滴加えてpHを8.8に調整します. 3)脱イオン水を加えて、最終容量を100mLに調整します。	バッファーは4°Cで最大1ヶ月間保存できます。	NaOHは腐食性があり、火傷を引き起こす可能性があります。常に適切な個人用保護具を着用してください。これには、白衣と手袋が含まれます。
	10% (wt/vol) SDS solution (RIPAバッファ用)	1) 10 mLの脱イオン水に10 gのSDSを加えます><。 2) 溶けるまで攪拌します. 3)脱イオン水を加えて、最終容量を100mLに調整します。	この溶液は、室温で最大6ヶ月間保存できます。溶液が沈殿した場合は、穏やかに加熱して再溶解します。	SDSは腐食性です。常に適切な個人用保護具を着用してください。これには、白衣と手袋が含まれます。SDSはドラフトで取り扱ってください。
	RIPA バッファー (2倍ストック)	1) デオキシコール酸ナトリウム 0.5 g、NP-40 1 mL、NaCl 0.876 g、1.5 M Tris (pH 8.8) 3.3 mL、10% (wt/vol) SDS 1 mL を 46 mL の脱イオン水に混ぜ合わせます><。 2) 溶けるまで攪拌します. 3)脱イオン水を加えて、最終容量を50mLに調整します。	2x RIPAストックは、4°Cで最大1ヶ月間保存できます。	SDSは腐食性です。常に適切な個人用保護具を着用してください。これには、白衣と手袋が含まれます。SDSはドラフトで取り扱ってください。
滅菌トリガー	組合	大腸菌0111:B4由来の凍結乾燥LPSをエンドトキシンフリー水に5 mg/mLの濃度で溶解します。	この溶液は、-20°Cで最大2年間保存できます。
	0.5 M ATP (英語)	凍結乾燥ATP1 gをエンドトキシンフリー水3.63 mLに溶解します。	この溶液は、分注し、-20°Cで最大2年間保存できます。
ウェスタンブロッティングソリューション	実行中のバッファ (5倍ストック)	1) 15 g の Tris 塩基、72 g のグリシン、および 5 g の SDS を 900 mL の脱イオン水に混ぜ合わせます><。 2)微粒子がなくなるまで攪拌します. 3)脱イオン水を加えて、最終容量を1Lに調整します。	バッファーは室温で最大6ヶ月間保存できます。	SDSは腐食性です。常に適切な個人用保護具を着用してください。これには、白衣と手袋が含まれます。SDSはドラフトで取り扱ってください。
	転送バッファ (ストック10倍)	1) 30.3 g の Tris 塩基と 72 g のグリシンを 900 mL の脱イオン水に混ぜ合わせます><。 2)微粒子がなくなるまで攪拌します. 3)脱イオン水を加えて、最終容量を1Lに調整します。	バッファーは室温で最大3ヶ月間保存できます。
	トリスバッファー生理食塩水とTween 20(TBST)	1) Tris base 2.42 g と NaCl 8.76 g を 850 mL の脱イオン水に溶解します 2)攪拌しながらHClを一滴加えてpHを7.4に調整します. 3)脱イオン水を加えて、最終容量を1 L. に調整します。 4) Tween 20 0.5 mL (最終濃度 0.05% (vol/vol)) を加えます。	溶液は室温で1ヶ月間保存できます。	HClは腐食性です。常に適切な個人用保護具を着用してください。これには、白衣と手袋が含まれます。HClはドラフトで取り扱う必要があります。
	5%(wt/vol)スキムミルクブロッキング溶液	5 gの脱脂粉乳を大さじ100 mLに溶かします。	溶液は4°Cで最大1週間保存できます。
一次抗体	Caspase-1 一次抗体	抗カスパーゼ-1抗体を10 mLの5%(wt/vol)スキムミルクブロッキング溶液10 mLに10 μLを加えて、抗カスパーゼ-1抗体を1:1,000(vol/vol)に希釈します。	最適な結果を得るには、実験ごとに新鮮にしてください。ただし、このソリューションは、効果を損なうことなく少なくとも3回使用できます。再利用する場合は-20°Cで保存してください。
	Caspase-11一次抗体	抗カスパーゼ-11抗体を10 mLの5%(wt/vol)スキムミルクブロッキング溶液10 mLに10 μLを加えて、抗カスパーゼ-11抗体を1:1,000(vol/vol)に希釈します。	最適な結果を得るには、実験ごとに新鮮にしてください。ただし、このソリューションは、効果を損なうことなく少なくとも3回使用できます。再利用する場合は-20°Cで保存してください。
	Caspase-3 一次抗体	抗カスパーゼ-3抗体と切断防止カスパーゼ-3抗体を1:1,000(vol/vol)に希釈するには、各抗体10 μLを同じ10 mLの5%(wt/vol)スキムミルクブロッキング溶液に加えます。	最適な結果を得るには、実験ごとに新鮮にしてください。ただし、このソリューションは、効果を損なうことなく少なくとも3回使用できます。再利用する場合は-20°Cで保存してください。
	Caspase-7一次抗体	抗カスパーゼ-7抗体と切断防止カスパーゼ-7抗体を1:1,000 (vol/vol) に希釈するには、各抗体 10 μL を同じ 10 mL の 5% (wt/vol) スキムミルクブロッキング溶液に添加します。	最適な結果を得るには、実験ごとに新鮮にしてください。ただし、このソリューションは、効果を損なうことなく少なくとも3回使用できます。再利用する場合は-20°Cで保存してください。
	Caspase-8 一次抗体	抗カスパーゼ-8抗体と切断防止カスパーゼ-8抗体を1:1,000(vol/vol)に希釈するには、各抗体10 μLを同じ10 mLの5%(wt/vol)スキムミルクブロッキング溶液に加えます。	最適な結果を得るには、実験ごとに新鮮にしてください。ただし、このソリューションは、効果を損なうことなく少なくとも3回使用できます。再利用する場合は-20°Cで保存してください。
	Caspase-9一次抗体	抗カスパーゼ-9抗体を1:1,000 (vol/vol) に希釈するには、10 mL の 5% (wt/vol) スキムミルクブロッキング溶液に 10 μL の抗体を添加します。	最適な結果を得るには、実験ごとに新鮮にしてください。ただし、このソリューションは、効果を損なうことなく少なくとも3回使用できます。再利用する場合は-20°Cで保存してください。
	HRP標識β-アクチン一次抗体	抗β-アクチン抗体を10 mLの5%(wt/vol)スキムミルクブロッキング溶液10 mLに2 μLを加えて、抗-アクチン抗体を1:5,000(vol/vol)に希釈します。	この抗体は、各実験で新鮮に調製する必要があります。
二次抗体	抗ウサギ抗体	西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識二次抗体を1:5,000(vol:vol)に2 μLの抗体を10 mLの5%(wt/vol)スキムミルクブロッキング溶液を加えて希釈します。	抗体希釈液は、毎回新鮮に調製する必要があります。
	抗マウス抗体	HRP標識二次抗体を1:5,000 (vol:vol) 10 mLの5%(wt/vol)スキムミルクブロッキング溶液に2 μLの抗体を加えて希釈します。	抗体希釈液は、毎回新鮮に調製する必要があります。
	抗ラット抗体	HRP標識二次抗体を1:5,000 (vol:vol) 10 mLの5%(wt/vol)スキムミルクブロッキング溶液に2 μLの抗体を加えて希釈します。	抗体希釈液は、毎回新鮮に調製する必要があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.45μmフィルター	ミリポア	SCHVU05RE
10 mLシリンジ	BDバイオサイエンス	309604
12ウェルプレート	コーニング	07-200-82
18G針	BDバイオサイエンス	305195
25Gの針	BDバイオサイエンス	305122
50mLチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	〒50-809-218
70 μmセルストレーナー	コーニング	431751
150 mm組織培養皿	コーニング	430597
182 cm2組織培養フラスコ	ジェネシー・サイエンティフィック	25から211
ATPの	インビボジェン	TLRL-ATPL
BBLトリプチカーゼ大豆スープ	BDバイオサイエンス	211768
ビーズバス	ケムグラスライフサイエンス	CLS-4598-009
バイオフォトメーター D30	エッペンドルフ	6133000010
セルスクレーパー	CellTreatサイエンティフィック製品	229315
CO2チャンバー	ベトエキップ	901703
キュヴェット	フィッシャーサイエンティフィック	14-955-129
解剖ハサミ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	221Sの
DMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11995年073
エタノール	Pharmco(ファーマコ)	111000200
ウシ胎児血清	バイオウエスト	S1620
濾紙	バイオ・ラッド	1703965
鉗子	フィッシャーサイエンティフィック	22-327379
Francisella novicida(U112株)	BEIリソース	NR-13
ゲンタマイシン	ギブコ	15750060
ヒートブロック	フィッシャーサイエンティフィック	〒23-043-160
単純ヘルペスウイルス1型(HF株)	ATCCの	VR-260
高グルコースDMEM	シグマ	D6171
加湿インキュベーター	サーモフィッシャーサイエンティフィック	51026282
IMDM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12440-053
インフルエンザA型ウイルス(A/プエルトリコ/8/34、H1N1 [PR8])	Hoffmann et al.
L929細胞	ATCCの	CCL-1	L929コンディショニング培地を作製するための細胞株
L-システイン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BP376-100
MDCK細胞	ATCCの	CCL-34	IAVウイルス力価を測定するための細胞株
マイクロ遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75002401
非必須アミノ酸	ギブコ	11140050
NP-40ソリューション	シグマ	492016
PBSの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10010023
ペニシリンとストレプトマイシン	シグマ	P4333
ペトリ皿	フィッシャーサイエンティフィック	07-202-011
フォスストップ	ロシュ	フォスロ
電源	バイオ・ラッド	〒164-5052
プロテアーゼ阻害剤錠	シグマ	S8820
水酸化ナトリウム	シグマ	72068
ピルビン酸ナトリウム	ギブコ	11360-070
スクエアシャーレ	フィッシャーサイエンティフィック	FB0875711A
卓上遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75004524
大腸菌0111:B4由来の超高純度リポ多糖(LPS)	インビボジェン	TLRL-3ペルプス
ベロ細胞	ATCCの	CCL-81	HSV1ウイルス力価を測定するための細胞株

の の 月 の シリーズ