ヒト涙液サンプル中のサイトカインを分析するためのマルチプレックスビーズベースのアッセイ

要約

出典:Balne, P. K., et al.涙サイトカインプロファイルの解析のためのビーズベースのマルチプレックスアッセイ。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、ヒトの涙液中のサイトカインを分析するためのビーズベースのマルチプレックスアッセイを示しています。この方法により、1つのサンプルから複数のサイトカインを同時に分析できるため、さまざまな病態生理学的条件での免疫応答を研究するための感度が向上します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>1. 涙液サイトカイン解析

1. 涙のコレクション:
   1. 被験者に診察椅子にゆったりと座ってもらい、ヘッドレストに頭を当てます。
   2. 被験者に見上げてもらい、シルマーストリップ(Whatman濾紙No.41でできています)を慎重に開き、ストリップの丸みを帯びた端を目の下円蓋に置き、被験者に目を5分間閉じるように指示します。涙を溜め込むときは、眼球表面の接触を最小限に抑えるために細心の注意を払ってください。
   3. 被験者に目を開けてもらい、ストリップを取り外し、滅菌済みの1.5mL微量遠心チューブに入れます。チューブをすぐに実験室に移すか、サイトカインプロファイリングの試験まで-80^°Cで保管してください。
2. 涙液フローストリップからの涙液サンプルの溶出:
   1. 涙液フローストリップを0.5cmの長さにカットし(試験する涙の量を標準化するため)、滅菌済みの1.5mL微量遠心チューブに入れます。
   2. アッセイバッファー30 μLを添加し、室温で5分間インキュベートした後、チューブを14,000 x gで1分間遠心分離します。
   3. 上清を別の1.5 mL微量遠心チューブに移し、ストリップを廃棄します。チューブを含むサンプルを氷上に置いて、溶出した涙液サンプルをすぐにサイトカインプロファイリングに使用します。
3. 試薬の調製:
   注:ビーズベースのマルチプレックスアッセイによって各サンプルで試験される41の分析物は、インターロイキン(IL)-1α、IL-1β、IL-Rα、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12 p40、IL-12 p70、IL-13、IL-15、IL-17A、インターフェロンアルファ(IFN-α)2、IFN-γ、IFN-γ誘導性タンパク質10(IP-10、CXCL10)、マクロファージ由来ケモカイン(MDC)、 マクロファージ炎症性タンパク質(MIP)-1αおよびMIP-1β、単球走化性タンパク質(MCP)-1、MCP-3、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、TNF-β、増殖制御がん遺伝子(GRO)、腫瘍成長因子α(TGF-α)、血管内皮増殖因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)、線維芽細胞成長因子(FGF)-2、血小板由来成長因子(PDGF)-AA、PDGF-AB/BB、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、エオタキシン、フラクタルカイン、可溶性CD40リガンド(sCD40L)、Fms様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt−3L)および活性化時に調節され、正常なT細胞発現および分泌タンパク質(RANTES)。
   1. 抗体ビーズ溶液(50X)バイアルを室温(20〜25^°C)に戻し、バイアルを1分間ボルテックスします。
   2. アッセイに必要なウェル数を数え、アッセイに必要な抗体ビーズカクテル溶液(1ウェルあたり25 μL)と各抗体ビーズ溶液(50倍)の量を計算します。
   3. 各抗体ビーズ溶液の計算量を添加してカクテル溶液を調製し、残りのビーズ希釈剤の量を添加して所望の最終容量まで充填します。カクテル中の各抗体の最終濃度が1Xであることを確認してください。ピペッティングエラーが発生した場合に備えて、常に少なくとも20%の余剰量のカクテル溶液を準備してください.
      手記：一例として、96ウェルアッセイの場合、3000 μLの抗体ビーズカクテル溶液を調製します。各抗体ビーズ溶液の必要量= 3000 /各抗体ビーズ溶液のストック濃度;各抗体ビーズ溶液3000/50 = 60 μL
      1. 41種類の抗体ビーズ溶液(60 X 41 = 2460 μL)をそれぞれ60 μLずつカクテルボトルに加え、540 μLのビーズ希釈液を抗体ビーズ混合物に加えると、3000 μLの最終作業溶液(1X)が得られます。
      2. 使用する前に、ビーズカクテル溶液を適切に混合してください。アッセイ後、残りの容量を2〜8^°Cで最大30日間保存します。
   4. QC 1 および QC 2 ストックに 250 μL の脱イオン水を加えて、品質管理 (QC) を調製します。
   5. ボトルを数回ひっくり返し、10秒間ボルテックスして適切に混合します。溶液を適切にラベル付けしたポリプロピレン製微量遠心チューブに移し、残りの溶液を最大30日間使用できる-20^°Cで保存します。
   6. 270 mLの脱イオン水270 mLを30 mLの10X洗浄バッファー溶液に加えて洗浄バッファーを調製し、よく混合します(希釈する前に、10Xバッファーを室温に戻して、すべての塩沈殿物を混合して溶解します)。未使用の洗浄バッファー(1X)は、最大30日間使用できる2〜8°Cで保存してください。
   7. ヒトサイトカイン標準ストック(全分析種10,000 pg/mL)を調製し、ストックバイアルに250 μLの脱イオン水を加えます。数回反転させ、バイアルを10秒間ボルテックスしてよく混ぜます。10分間放置し、ストック溶液を適切にラベル付けしたポリプロピレン製マイクロ遠心チューブに移します。アッセイ後、残りの溶液を-20^°Cで保存し、最大30日間使用できます。
   8. アッセイバッファーを用いた5倍段階希釈(50 μL -> 200 μL)により、作業用ヒトサイトカイン標準試料を調製し、2000、400、80、16、および3.2 pg/mLを得ます。
   9. 標準試料の調製後、60分以内に作業標準を使用し、アッセイバッファーをブランク/バックグラウンド(-pg/mL)として使用します。
4. ビーズベースのマルチプレックスアッセイによるサイトカインプロファイリング:
   1. すべての試薬を室温に戻し、5〜10秒間ボルテックスしてから、96ウェルマイクロタイタープレートに添加します。溶出した涙液サンプルをアッセイ前に-80^°Cで保存する場合は、凍結した涙液抽出物を氷上で解凍し、1000 X gで5分間遠心分離します。
   2. ヒトサイトカイン標準試料[0(ブランク)、3.2、16、80、400、2,000、10,000 pg/mL]、QC1、QC2、およびサンプル用の垂直構成のアッセイワークシートを調製します。
   3. プレートの各ウェルに200 μLの1X WASHバッファーを加え、プレートシーラーで密封し、室温(20-25^°C)のプレートシェーカーで10分間保持します。
   4. プレートを反転させ、吸収性タオルに数回テープで貼り付けて1X洗浄バッファーをデカントし、ウェルに残っている洗浄バッファーを取り除きます。
   5. 各作業ヒトサイトカイン標準試料、QC1、QC2、ブランク(アッセイバッファー)、およびサンプルを25 μLを適切なウェルに加えます。
   6. 各ウェルに25 μLのアッセイバッファーを加えます。
   7. 各ウェルに25 μLの1X抗体ビーズカクテル溶液を添加します。抗体ビーズ溶液は感光性であるため、プレートをプレートシーラーで密封し、アッセイ中に光から保護するためにアルミホイルで覆います。
   8. プレートを4^°Cでシェーカーで一晩インキュベートします。
   9. プレートを自動磁気プレートワッシャーのプレートラックに置きます。1分間放置して、ウェルの底に磁気ビーズを沈殿させ、ウェルの内容物を吸引します。ウェルあたり200μLの洗浄バッファーを加え、1分間放置した後、ウェル内容物を吸引します。もう一度洗浄を繰り返します(プレート洗浄の場合は、キットの製造元の指示に従ってください)。
   10. 各ウェルに25 μLの検出抗体溶液を加え、プレートを密封し、アルミホイルで覆い、シェーカーで室温で60分間インキュベー
   トします。
   11. 各ウェルに25 μLのストレプトアビジン-フィコエリトリン溶液を添加し、プレートを密封し、アルミホイルで覆い、シェーカーで室温で30分間インキュベー
   トします。
   12. プレートを磁気プレートワッシャーの上に置きます。1分間放置してから、ウェルの内容物を吸引します。ウェルあたり200μLの洗浄バッファーを添加します。1分間放置してから、ウェルの内容物を吸引します。もう一度洗濯を繰り返します。
   13. 各ウェルに150 μLのシース液を添加し、プレートを室温で5分間シェーカーに置き、抗体ビーズを再懸濁します。
   14. ビーズベースのマルチプレックスアッセイプレートリーダーを使用してプレートをすぐに読み取り、5パラメータカーブフィッティングアルゴリズムを使用してサイトカイン濃度を分析します。涙液サイトカインプロファイリングの概略フロー図を図1に示します。
5. アッセイプレートの読み取り(装置のセットアップ)とデータ解析:
   1. ビーズベースのマルチプレックスアッセイリーダーのスイッチを入れ、レーザーを30分間予熱します。
   2. ビーズベースのマルチプレックスアッセイソフトウェアを起動します。「自動メンテナンス」タブで、「キャリブレーション検証」オプションを選択します。キャリブレーションおよび検証ビーズの各試薬バイアルを30秒間ボルテックスします。各試薬を5滴ずつ指定のウェルに入れます。指定された貯水池に脱イオン水と70%エタノールを入れます。

結果

図1:涙液サイトカインプロファイリングの概略フロー図。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Milliplex MAPヒトサイトカイン/ケモカイン磁気ビーズパネル-1キット	Merck, アメリカ	HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D ルミネックス機器	Luminex Corp、オースティン、テキサス州、米国
xPonent ソフトウェア	Luminex Corp、オースティン、テキサス州、米国
RBXGenerator ソフトウェア	BIO-RAD、フランス
バイオプレックスマネージャー 6.1	BIO-RAD、フランス
プレートシェーカー	コーニング(米国)
TECANマイクロプレートウォッシャー	Tecan, スイス	ハイドロスピード
ピペット	メトラー・トレド、カリフォルニア州、米国
1.5mlマイクロ遠心チューブ	Axygen, アメリカ	MCT-150-Cシリーズ
シルマー涙流試験紙	アイケア&キュア、アメリカ	101657
Flexmap 3Dキャリブレーションキット	Luminex Corp、オースティン、テキサス州、米国	〒40-028
Flexmap 3D検証キット	Luminex Corp、オースティン、テキサス州、米国	〒40-029
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