Immuno-RNA Fluorescence In Situ ハイブリダイゼーションを使用した SARS-CoV-2 の可視化

1. カバーガラス上で培養したVero細胞中のSARS-CoV-2 RNA-FISH

>1日目

1. 細胞の固定と透過化
   1. 感染細胞を3.7% w/v PFA溶液でRTで1時間固定します。
   2. 3.7% PFA 溶液を吸引し、1x PBS を使用して細胞を 2 回洗浄します。
   3. PBST溶液で細胞をPBST溶液で10分間浸透させ、攪拌します。
   4. PBSTを吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄します。
2. 検出
   1. 1x PBS溶液を吸引し、RTで2x SSCで細胞を2回洗浄します。
   2. 2x SSC溶液を吸引し、少なくとも300 μLのプローブハイブリダイゼーションバッファーを添加してサンプルをプレハイブリダイズします。細胞を含むウェルを覆い、37°Cで30分間インキュベー
   トします。
   3. プローブハイブリダイゼーションバッファーに1.2 pmolのプローブ混合物を添加して、プローブ溶液を調製します。
      1. 1 μMプローブストック1.2 μLを使用して、300 μLのワーキングストックを調製します。
   4. プレハイブリダイゼーション溶液を取り出し、カバースリップを加湿チャンバーに移します。
      1. 30-50 μLのプローブ溶液をパラフィルムにピペットで移し、個々の液滴を形成します。
   5. サンプルを37°Cで一晩(12〜18時間)インキュベートします。

>2日目

1. カバースリップを12ウェルプレートに戻し、400 μLのプローブ洗浄バッファーを37°C.
   で4 x 5分間洗浄して、余分なプローブ溶液を除去します。 手記：30〜50 μLのアリコートをパラフィルム上やカバースリップの下に置いてインキュベーションする代わりに、300 μLのプローブ溶液を12ウェルプレートのカバースリップに直接加えます。この手順は簡単ですが、かなりの量の試薬が必要です。プローブ洗浄バッファーを37°Cに加熱してから使用してください。必要なバッファーの量を計算し、15 mLのコニカル遠心チューブに移します。
2. RTで5x SSCTを使用してサンプルを2 x 5分間洗浄します。
3. 5x SSCT溶液を1x PBSに交換し、増幅するまでサンプルを4°Cで保存します。

3. 増幅

1. ウェルから1x PBS溶液を取り出し、各ウェルに少なくとも300 μLの増幅バッファーを加えます。サンプルをRTで30分間インキュベートします。
2. 各HCRヘアピン(h1およびh2)を、別々のチューブで目的のボリュームをスナップ冷却して準備します。
   1. 300 μLの増幅溶液を調製するには、各ヘアピンに18 pmolを使用します(たとえば、300 μLの場合は、3 μMストックヘアピン溶液を6 μL使用します)。
   2. ヘアピン溶液をチューブに移します。
   3. 95°Cで90秒間インキュベートします。
   4. 暗闇で30分間RTまで冷やします。
3. スナップ冷却した「h1」ヘアピンと「h2」ヘアピンを増幅バッファーに追加して、ヘアピン混合物を調製します。
4. ヘアピン混合物30〜50μLをパラフィルムに滴下します。
5. サンプルを室温で一晩(12〜18時間)暗所でインキュベートします。

3日目

6. カバースリップを12ウェルプレートに戻し、攪拌しながらRTで5x SSCTで5 x 5分間洗浄することにより、余分なヘアピンを取り除きます。
7. 5x SSCT バッファーを吸引し、1x PBS.
   と交換します 手記：必要に応じて、RNA-FISHサンプルを標準的な免疫蛍光アッセイで使用し、続いて核を染色します(セクション1.4を参照)。

4. 核染色とスライド実装

1. 1x PBS溶液を吸引し、1x PBS溶液中の4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI、0.2 μg/mL)と交換します。
2. サンプルを暗所の室温で10分間インキュベートします。
3. DAPI溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄します。
4. 封入剤をそれぞれ10 μLずつ2滴ずつセットし、1枚のスライドに2枚のカバースリップを置けるように、液滴が十分に離れていることを確認してください。
5. 清潔なタオルでカバースリップを軽くたたいて余分な液体を取り除き、細胞を下に向けて色あせ防止封入剤に入れます。
6. マウントされたサンプルを暗闇の乾燥した平らな面に置き、硬化させます。
7. 硬化後、カバースリップの端をVALAPシーラントまたはマニキュアで密封して、サンプルが乾燥するのを防ぎます。

2. HAE培養におけるSARS-CoV-2 RNA-FISH

>1日目

1. HAE文化の定着と浸透
   1. 培地を吸引し、3.7% PFA 溶液を使用して RT で 1 時間感染細胞を固定します。
   2. 3.7% PFA溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄します。
      1. 3.7% PFA 溶液を Transwell インサートの下に 1x PBS と交換します。
   3. PBSを廃棄し、100% MeOHを-20°Cに予冷した状態で2 x 5分間の洗浄を使用してサンプルを脱水します。
   4. 2回目の洗浄後、バッファーを新しく冷やしたMeOHと交換し、トランズウェルインサートの下で透過化します。-20°Cで一晩保存してください。

>2日目

2. リハイドレーション
   75% MeOH/25% PBST、50% MeOH/50% PBST、25% MeOH/75% PBTS、100% PBST (2回) の段階的な一連の MeOH/PBST 溶液 (それぞれ 5 分間) を氷上で再水和します。
   1. 細胞を氷上で50%5x SSCT/50%PBSTで5分間洗浄します。
   2. 細胞を氷上で5分間、5x SSCTで洗浄します。
   3. 5x SSCT バッファーを 1x PBS に交換します。
3. 検出
   1. 細胞(トランズウェルインサート内)を氷上で5分間インキュベートし、100 μLのプローブハイブリダイゼーションバッファーを加えます。次に、プレートをインキュベーターに37°Cで30分間移します(プレハイブリダイゼーション)
      手記： プローブハイブリダイゼーションバッファーは、使用前に37°Cに予熱する必要があります。必要容量を計算します:1つのトランズウェルインサートに100μLが必要です。
   2. プローブ溶液を準備します。1 mLのプローブ溶液には4 pmolのプローブが必要なため、1 μMプローブストック溶液4 μLを1 mLのプローブハイブリダイゼーションバッファーに加え、よく混合します< / > 手記：RNA検出には、トランズウェルインサートあたり100 μLのプローブ溶液を使用します。プローブ溶液を氷上に置いたままにして、プレハイブリダイゼーションステップが終了します。
   3. プレハイブリダイゼーション溶液を取り出し、プローブ溶液を添加します。
   4. 細胞を37°Cで一晩(12-18時間)インキュベートします。

3日目

5. 余分なプローブを除去し、100 μL のプローブ洗浄バッファーを 37 °C で 15 分間 x 4 回洗浄します。
6. サンプルをRTで5x SSCTで2 x 5分間洗浄します。
7. 5x SSCTを1x PBSに交換し、増幅するまでサンプルを4°Cで保存します。

4. 増幅

1. サンプルを増幅バッファーと室温で30分間インキュベートすることにより、サンプルを前増幅します。
2. 各ヘアピンは、別々のチューブで必要なボリュームをスナップ冷却して準備します。
   1. 500 μLの増幅溶液を調製するには、各ヘアピンに30 pmolを使用します(例:500 μLの場合、10 μLの3 μMストックヘアピン溶液を使用します)。
   2. ヘアピン溶液をチューブに移します。
   3. 95°Cで90秒間インキュベートします。
   4. 暗闇で30分間RTまで冷やします。
3. RTで500μLの増幅バッファーにスナップ冷却したヘアピンをすべて加えて、ヘアピン溶液を調製します。
4. プレアンプ溶液を取り外し、完全なヘアピン溶液を追加します。
5. サンプルを一晩(12〜18時間)RTで暗所でインキュベートします。
6. RTで5x SSCTで2 x 5 min、2 x 15 min、1 x 5 minの洗浄により、余分なヘアピンを取り除きます。
7. 5x SSCT溶液を1x PBSに交換し、4°Cで2〜3日以内に保存するか、直接核染色に進みます
   手記： 必要に応じて、RNA-FISHサンプルを標準的な免疫蛍光アッセイで使用し、続いて核染色を行います(セクション3を参照)。

5. 核染色とスライド実装

1. 1x PBS溶液を吸引し、1x PBS中のDAPI溶液(0.2 μg/mL)と交換します。
2. サンプルを暗所の室温で10分間インキュベートします。
3. DAPI溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄します。
4. トランズウェルインサートの切り抜きメンブレンを、セルを上に向けて10 μLの退色防止封入剤に置き、メンブレンに封入剤(5 μL)を追加します。
5. メンブレンをカバースリップで覆います。
6. 取り付けられたサンプルを暗闇の中で乾燥した平らな面で硬化させます。
7. 硬化後、カバースリップの端をVALAPシーラントまたはマニキュアで密封して、サンプルが乾燥するのを防ぎます。

>3. Vero細胞とHAE培養物の免疫蛍光法による解析

>注:細胞株の場合は3日目、HAE培養の場合は4日目に免疫蛍光アッセイを実施してください。モデルごとに異なるアプローチを使用します。すべての違いが明確に示されています。

1. ウェルから1x PBS溶液を吸引します。
2. 1% w/v ウシ血清アルブミンをPBST溶液中で37°Cで30分間インキュベートし、サンプルをブロッキングします。
3. ブロッキング溶液で適切な希釈液を調製して一次抗体を調製し、インキュベートします。
   1. カバースリップ上のVeroセルの場合:
      1. 抗体溶液の滴(30-50 μL)を湿度チャンバー内のパラフィルムに置きます。
      2. 細胞を下に向けて抗体滴にカバースリップを置きます。
   2. HAEの場合は、インサート内のブロッキング剤を抗体溶液(100 μL)に交換し、サンプルを加湿チャンバーでインキュベートします
      注:一次抗体を用いた各インキュベーションの時間と温度を調整してください。典型的なパラメータは、室温で2時間、または4°Cで一晩です。
4. サンプルをPBSTで3 x 5分間洗浄します。
   1. カバースリップ上の細胞の場合は、12ウェルプレートに移し、PBST溶液を加えます。
   2. HAE培養の場合は、抗体溶液をPBST溶液に置き換えてください。
5. 共焦点顕微鏡で使用可能な光源とフィルターを確認してください。
6. 宿主の種に応じて二次抗体を選びます。蛍光色素分子のパラメータ(励起波長と発光波長、スペクトル幅、利用可能な光源に応じた励起効率)を選択します。
   手記：スペクトルパラメータは、オンラインツールを使用してモデル化できます(材料の表を参照)。
7. ブロッキング溶液で希釈することにより、適切な二次抗体溶液を調製します。
8. 二次抗体(6.3など)とインキュベートしますが、37°Cで1時間インキュベートします。
9. ステップ3.4のようにサンプルを洗浄します。
10. 核染色とスライド埋込
    1. カバースリップ上のセル用
       1. PBSTを吸引し、1x PBS溶液中のDAPI(0.2 μg/mL)と交換します。
       2. サンプルを暗所の室温で10分間インキュベートします。
       3. DAPI溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄します。
       4. カバースリップを10 μLの封入剤の滴下に置き、セルを下に向けて置きます。
       5. カバースリップをマニキュアで密封します。
    2. HAEカルチャーの場合
       1. 1x PBSTを吸引し、1x PBS溶液中のDAPI(0.2 μg/mL)と交換します。
       2. サンプルを暗所の室温で10分間インキュベートします。
       3. DAPI溶液を吸引し、1x PBSで細胞を2回洗浄します。
       4. 切り抜きメンブレンを10 μLの封入剤の滴下にセルを上に向けて置き、メンブレンに追加(5 μL)の封入剤を加えます。
       5. メンブレンをカバースリップで覆います。
       6. カバースリップをマニキュアで密封します。

4. 共焦点顕微鏡

1. 使用する蛍光色素を指定して、トラックを定義します。
2. スキャンモードと速度を選択します。
3. 各蛍光色素分子のレーザー出力、ゲイン、オフセットの値を、それぞれのネガティブコントロールと比較することで調整します:ウイルスの場合は模擬感染細胞、細胞タンパク質の場合は、適切な宿主からのアイソタイプコントロール抗体で染色したサンプル
。
4. 3D画像を取得するには、zスタックモードをアクティブにして、上限と下限を設定します。ステップサイズ/番号を設定します.
   手記：コロナウイルスの画像診断の詳細については、こちらをご覧ください。