ヒト血清中の中和抗体価を測定するためのマイクロ中和アッセイ

要約

出典:Gross, F. L. et al., MDCK-SIAT1細胞を用いたマイクロ中和アッセイによるヒト血清中のA(H3N2)ウイルスに対するインフルエンザ中和抗体応答の測定。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオは、ヒト血清中のα2,6結合シアル酸を過剰発現するMadin-Darby Canine Kidney 細胞を使用して中和抗体を測定するためのマイクロ中和アッセイを示しています。このアッセイは、インフルエンザヒト血清学によく使用されます

プロトコル

すべてのインフルエンザウイルスは、微生物学および生物医学研究所のバイオセーフティー(BMBL)で定義されている適切なバイオセーフティーレベル要件(BSL-2以上)に従って取り扱われるべきです。

>1. 試薬と出発物質の調製

1. Madine Darby Canine Kidney-α2,6-sial transferase(MDCK-SIAT1)細胞および無菌細胞培養培地を調製します。
   1. 高グルコース、10% v/v 熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、2 mM L-グルタミン、1 mM ピルビン酸ナトリウム、1 mg/mL G418 硫酸塩 (例: ジェネチシン)、および 100 U/mL ペニシリン 100 μg/mL ストレプトマイシン (オプション) を含む 500 mL の Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) を使用して、MDCK-SIAT1 細胞培養培地を調製します。0.2 μMの細孔サイズのメンブレンをろ過して滅菌します。G418硫酸塩は、MDCK-SIAT1細胞のプラスミド安定性を確保するために添加されます。
   2. MDCK-SIAT1細胞株を調製します。30 mLの滅菌細胞培養培地を含む162 cm²組織培養フラスコで、2 - 2.5 x 10⁶ MDCK-SIAT1細胞を含むシードフラスコを調製し、5% CO₂で37°Cで2日間インキュベートします。これは、組織培養感染線量 (TCID) 測定および MN アッセイに使用されます><。 手記：MDCK-SIAT1細胞は、ドイツのマールブルクにあるM.Matrosovich博士のご厚意により提供されました。この細胞株は市販のものも入手できます(材料表を参照)。
2. 500 mLのDMEM高グルコース、0.3%ウシ血清アルブミン(BSA)画分V、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および20 mM N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸(HEPES)を使用して、滅菌ウイルス増殖培地を調製します。0.2 μMの細孔サイズのメンブレンをろ過して滅菌します。
3. 0.01 M PBSを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に0.75%(v / v)モルモット赤血球(gpRBC)を調製します(pH 7.2)。
4. DMEM高グルコース、1%ウシアルブミンフラクションV(BSA)、100 U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシン、および20 mM HEPESを使用して、滅菌ウイルス希釈液を調製します。0.2 μmの細孔サイズのメンブレンでろ過して滅菌し、各アッセイ用に新たに調製します。
5. コールドセル固定液をPBS(0.01 M PBS、pH 7.2)中の80%コールドアセトンとして調製します。
6. PBS(0.01 M PBS pH 7.2)および0.3%(v/v)tween-20を使用して洗浄バッファーを調製します。
7. PBS(0.01 M PBS、pH 7.2)、0.3%(v/v)tween-20、および5%脱脂粉乳を使用して抗体希釈液を調製します。
8. 抗インフルエンザA NPマウスモノクローナル抗体クローンA1およびA3プールを一次抗体として使用します。滴定によって決定される最適な濃度で抗体希釈液で希釈します。
9. 二次抗体として、セイヨウダイザルペルオキシダーゼ(HRP)に結合したヤギ抗マウスIgGを使用してください。滴定によって決定される最適な濃度で抗体希釈液で希釈します。
10. pH 5の0.05 Mリン酸クエン酸緩衝液中のo-フェニレンジアミン二塩酸塩(OPD)を使用してペルオキシダーゼ基質を調製します。1 capsule/100 mL deionized H₂Oを溶解して0.05 Mリン酸クエン酸緩衝液を調製し、使用直前に1 OPD錠剤(10 mg)/20 mLのリン酸クエン酸緩衝液を溶解します。
11. OPDストップ溶液として0.5Mの硫酸を使用してください。ケミカルフード内で、28 mLの18 M硫酸ストックを972 mLの脱イオンH₂Oに加えます。
12. ヒトおよび動物の血清の治療
    1. MNアッセイで使用したヒト血清を、アッセイの30分前に56°Cのウォーターバスで熱不活化します。すぐに使用するか、必要に応じて、解凍した血清を4°Cで24時間以内保存してください。より長い保存期間が必要な場合は、血清を-20°C以下で凍結して保存してください。
    2. MNアッセイで使用した動物血清を受容体破壊酵素(RDE)で処理し、アッセイ前に以下のように熱不活化します。
       1. セラを37°Cの水浴で解凍し、氷の上に置きます。1容量の動物血清サンプルと3容量のRDEを混合します。37°Cで18〜20時間インキュベートします。
       2. RDE処理した血清を56°Cで30分間熱不活化し、各サンプルに6容量のPBS、pH 7.2を加えて、最終前希釈を1:10にします。必要に応じて、解凍した血清を4°Cで24時間以内保存してください。より長い保存期間が必要な場合は、血清を-20°C以下で凍結保存してください
          手記：動物血清には、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素またはHAに結合し、インフルエンザ特異的抗HA抗体の結合を阻害する可能性のある種々のシアル酸糖鎖が含まれていることがある。したがって、MNアッセイの前にすべての動物血清をRDE処理して、血清サンプル中のこれらの非特異的ウイルスHA結合剤を除去する必要があります。

2. MDCK-SIAT1細胞培養の継代

>注:すべての細胞培養は、汚染を防ぐために生物学的安全キャビネットで行わなければなりません。

1. 細胞単層から細胞培養培地を162 cm²フラスコでデカントします。単層をトリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)ですすぐことにより、細胞をトリプシン化します。5 mLのトリプシン-EDTAを添加して、細胞単層を覆います。37°C、5%二酸化炭素、CO₂で、単分子層が剥離するまでインキュベートします(5〜10分)。トリプシン処理された細胞を含む各フラスコに15 mLのMDCK-SIAT1細胞培養培地を加え、ピペットで上下させて別々の細胞に交換します。
2. 血球計算盤とトリパンブルーを使用して、細胞数と生存率を決定します。30 mLの細胞培養培地を2-2.5 x 10⁶細胞/フラスコで含ませた新しい162 cm²組織培養フラスコに細胞を播種し、TCIDおよびMNアッセイで使用するために5% CO₂で37°Cで2日間インキュベートします。細胞を4 - 5 x 10⁶細胞/フラスコで播種し、ウイルス増殖に使用するために5%_CO2と37°Cで2日間インキュベートします
   手記：播種密度は、より短いまたはより長い培養期間が必要な場合に調整することができます。ウイルスの増殖には、細胞が100%以上のコンフルエント度に達する必要があります。Tissue Culture Infection Dose(TCID)およびMNアッセイの場合、細胞は75〜95%のコンフルエンシーである必要があります(図1)。

3. MDCK-SIAT1細胞におけるA(H3N2)ウイルスの増殖

>注:A(H3N2)ウイルスは、標準的なプロトコルに従って、生後10〜11日の胚鶏の卵、またはMDCK-SIAT1細胞培養のいずれかで増殖することができます。MDCK-SIAT1細胞は、ウイルス接種のために100%以上のコンフルエントに達する必要があります。ウイルスシードストックには、複数回希釈した接種物を接種することができます。最高の収穫HAと感染力を持つ接種希釈液は、さらなるMNアッセイに使用できます。

1. 細胞単層(>100%コンフルエント)から細胞培養培地を162 cm²フラスコで取り出します。単層を15 mLの滅菌0.01 M PBS、pH 7.2、およびデカントで2回洗浄します。
2. 1つのフラスコをコントロールとして標識し、20 mLのウイルス増殖培地を添加します。フラスコを37°Cで5%CO₂とインキュベートします。このフラスコはそのままにしておき、ウイルス増殖の1日目以降の比較に使用してください。
3. 10 mLの滅菌ウイルス増殖培地をフラスコに加え、すべてのフラスコを37°C、5%CO₂でインキュベートします。インフルエンザウイルスストックのバイアルを室温で解凍し、氷の上に置きます。ウイルス増殖培地で標的希釈液まで希釈します
   手記：ターゲット希釈は、ウイルスストックのHA力価に基づいて調整できます。1:1000に希釈した接種材料を調製するには、9.9 mLの滅菌ウイルス増殖培地に100 μLのウイルスを加えます。穏やかに反転させ、1:100希釈液1mLを9mLの滅菌ウイルス増殖培地に移し、1:1000希釈接種物に対して穏やかに反転します。氷の上に置きます。
4. コントロールフラスコを除くすべてのフラスコをインキュベーターから取り外します。MDCK-SIAT1細胞のフラスコからウイルス増殖培地を取り出し、各フラスコに希釈したウイルス10mLを接種します。フラスコを37°C、5%CO₂で1時間インキュベートし、フラスコを15分ごとに回転させます。
5. フラスコから5 mLの接種物を取り出し、1 μg / mLのトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン処理トリプシン(TPCK-トリプシン)を含む15 mLのウイルス増殖培地と交換します。.フラスコを37°C、5%CO₂で16〜18時間インキュベートします。
6. 一晩インキュベーションした後、100倍の顕微鏡倍率でフラスコを観察し、細胞に対する細胞変性効果(CPE)を探します。フラスコから15〜17 mLのウイルス上清を取り除き、2 μg / mLのTPCK-トリプシンを含む15〜17 mLの新たに調製したウイルス増殖培地と交換します。.
7. フラスコを37°C、5%CO₂でインキュベートします。単層のCPEをモニターし(細胞コントロールフラスコとの比較)、収穫まで0.75%gpRBCでHAを定期的に(4時間ごとに)チェックします。
   1. HA 96ウェルマイクロタイタープレートをセットします。0.01 M PBS、pH 7.2 50 μL をウェル A2 - A12 および B2 - B12 (重複) に加え、ウェル H1 - H12 をコントロール用に加えます。
   2. A1およびA2に100μLのウイルス上清を添加し、A1およびB1からA12およびB12までの2倍段階希釈を行います。A12とB12を混合した後、50μLを廃棄してください。0.75% gpRBCs 50 μL を行 A、B、H に添加します。
   3. プレートを軽くたたいて、室温で1時間インキュベートします。
      1. 96ウェルマイクロタイタープレートを45°から60°の角度で傾けて、ウイルス上清のHAを測定します。
      2. 赤血球凝集のためのプレートを読み取ります。完全な赤血球凝集を達成するウイルスの最高希釈度は、特定のウイルスの HA 滴定エンドポイントと見なされます。ウイルスの最高希釈率と完全赤血球凝集の逆数をウイルスのHA力価として記録します。
         手記：H列(コントロール)に落ち着いたRBCは「走行」を開始し、重力により小さな涙滴形を形成する必要があります。コントロールウェルのRBCが運転を終了するまで待ってから、ウイルス滴定ウェルのRBCボタンを読み取ります。RBCボタンを示して「走る」ものは、赤血球凝集を達成しません。赤血球凝集を完全に阻害するウイルスの最高希釈率を、ウイルスの終点HA力価として特定します。
8. ウイルス培養物のHAが頭打ちになるか、ウイルス培養物が標的HA(例えば、>16HA単位)に達したとき、ただし細胞単層が有意なCPEを示し始める前に、ウイルスを採取します。
   1. ウイルス培養上清を300 x gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞破片をペレット化します。ウイルスハーベストを含む清澄化された上清をきれいなチューブに移します。ウイルスを含む上清を使い捨ての滅菌極低温バイアルに分注し、-70°C以下で直ちに凍結します
      手記：MNアッセイに使用されるウイルスストックは、感染力価が高く、欠陥粒子が最小限に抑えられている必要があります。MNアッセイで100 TCID₅₀/50 μLを達成するためのウイルスストックの最小希釈率は1:100です。
      手記：MNアッセイで使用されるウイルスストックは、解凍して再凍結しないでください。

4. ウイルスのTCIDの決定

1. 1日目:ウイルス滴定
   1. ウイルスのバイアルを室温で解凍し、すぐに氷の上に置きます。
   2. ^10-2と^10-3の2つの異なる開始希釈でウイルスをテストします。100 μLのウイルスを9.9 mLのウイルス希釈液に加えて、^10-2希釈します。^10-2希釈液1mLを9.0mLのウイルス希釈液に加え、^10-3希釈します。
   3. 2枚のマイクロタイタープレート(^10-2希釈用のプレート1と^10-3希釈用のプレート2)を使用して、96ウェルマイクロタイタープレートのカラム1を除くすべてのウェルに100μLのウイルス希釈液を添加します。
   4. 1/2log₁₀希釈(^10-2、^10-2.5、^10-3など)を行います。希釈液開始146 μLのウイルスをカラム1のすべてのウェルに加え、46 μLをカラム1からカラム11まで連続して移します(図2)。ウェル間でピペットチップを交換します。カラム11を混合した後、チップを46μL希釈して廃棄します。
   5. カラム 12 を Cell Control (CC) として使用します。このカラムにはウイルス希釈剤のみが含まれています。37°C、5%CO 2で1時間インキュベートします_。
2. 1日目:MDCK-SIAT1細胞
   の調製 手記：MDCK-SIAT1細胞単層は、TCIDおよびMNアッセイで75〜95%のコンフルエンシーに達する必要があります。162 cm²フラスコ1本で95%の密度で、マイクロタイタープレート~4 - 5枚を播種するのに十分な細胞が得られるはずです。
   1. 75 - 95%コンフルエント単層を20 mL PBSで洗浄し、培地中のFBSを除去します。次のように細胞をトリプシン化します。
      1. 単層を滅菌PBSですすぎ、7mLのトリプシン-EDTAを加えて細胞単層を覆います。フラスコを平らに置き、37°C、5%CO₂で単層が剥離するまでインキュベートします(約5〜10分)。トリプシン化細胞を含む各フラスコに7 mLのウイルス希釈液を加えます。
   2. ウイルス希釈剤で細胞を洗浄し、FBSを除去します。
      1. ピペットで優しく上下に動かして、細胞を分離します。細胞を50mLの円錐管に移します。チューブにウイルス希釈液を入れます。
      2. 485 x gで5分間遠心分離し、ウイルス希釈液をデカントし、新鮮な50 mLウイルス希釈液と交換し、485 x gで5分間遠心分離します。ウイルス希釈液をデカントし、新しいウイルス希釈液(10 mL/フラスコ)で置き換えてペレットを再懸濁します。
   3. 血球計算盤とトリパンブルーを使用して、細胞数と生存率を決定します。ウイルス希釈液による細胞濃度を1.5 x 10⁵細胞/mLに調整します。
   4. 希釈したMDCK-SIAT1細胞100 μLをマイクロタイタープレートの各ウェル (1.5 x 10⁴ cells/well) に加え、プレートを覆います。37°C、5%CO₂で18〜20時間インキュベートします。
3. 2日目:ELISA
   1. 細胞の固定
      1. マイクロタイタープレートから培地を取り出します。各ウェルを200μLのPBSで洗浄します。各ウェルに300 μLの冷たくした80%アセトンを加え、室温で10分間インキュベートします。固定剤を取り外し、プレートを風乾させます。
   2. ELISAの
      1. 一次抗体の添加
         手記：抗インフルエンザA NPモノクローナル抗体は、ELISAの一次抗体として過剰に使用する必要があります。.一次抗体の各ロットに対する最適な抗体希釈率を決定するには、MNで抗体滴定を行います。一次抗体の濃度が過剰で、シグナル/バックグラウンド比が最も高いものを選択してください。
         1. 抗インフルエンザA NPモノクローナル抗体(一次抗体)を抗体希釈液中の目標濃度に希釈します(例:1000:1000の目標希釈液に30 mLの一次抗体を30 mLに加えます)。
         2. プレートを300 μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。希釈した一次抗体100 μLを各ウェルに加えます。室温で1時間インキュベートします。
      2. 二次抗体の添加
         注:ヤギ抗マウス免疫グロブリン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合したIgGは、ELISAの二次抗体として過剰に使用する必要があります。.抗体滴定を行うことにより、二次抗体の各ロットに最適な抗体希釈を決定します。二次抗体の濃度が過剰で、シグナルバックグラウンド比が最適なものを選択してください。
         1. HRP抗体(二次抗体)に結合したヤギ抗マウスIgGを抗体希釈液中の標的濃度まで希釈します(例:7.5 μLの二次抗体を30 mLの抗体希釈液に加えて、目標1:4000に希釈します)。
         2. プレートを300μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。希釈した二次抗体100 μLを各ウェルに加えます。室温で1時間インキュベートします。
      3. 基板添加とプレート読み取り
         1. プレートを300 μLの洗浄バッファーで5回洗浄し、糸くずの出ないワイプで軽くたたいます。
         2. 調製したばかりの基質100 μLを各ウェルに加え、発色が飽和し、細胞制御ウェルの光学濃度(OD)が<0.2になるまで室温でインキュベートします。
         3. 100 μLの停止溶液をすべてのウェルに加えます。マイクロプレート分光光度計を使用して、490 nmのウェルの外径を読み取ります。
4. TCID ₅₀ の計算
   1. セルコントロールの外径中央値₄₉₀を計算します(列12)。
   2. OD₄₉₀がCC井戸の_OD490の中央値の2倍を超えるテスト井戸を「陽性」とみなし、そうでなければ「陰性」とみなす。
   3. Reed-Muench法を使用してウイルスの_TCID50を計算します。
      1. 各希釈で陽性と陰性の数を決定します。
      2. 表 1 に示すように、"累積陽性"、"累積陰性"、"比率"、"% 陽性" を計算します。
      3. 以下を使用して、>50% の陽性を示す希釈と <50% の陽性を示す希釈との間の「比例距離」を計算します。
         
         手記：1/2 log 希釈の補正係数は 0.5 です。たとえば、表 1 では、(80 − 50)/(80 − 20) x 0.5 = 0.25
      4. ウイルスTCID₅₀は、>50%が陽性であることを示す希釈に比例距離を加算して計算します。
         手記：たとえば、表 2 では、TCID₅₀ は 10-5^+(-0.25) = 10-5.25 です。注:これは、100μL(または^10-5.25 / 100μL)あたりのウイルスの_TCID50です。
   4. ウイルスの希釈率を計算します。MNアッセイの場合は、ウイルスを200 TCID₅₀/100 μL(ウェルあたり100 TCID₅₀/50 μLに相当)に希釈します。
      手記：表 1 の例では、1 TCID₅₀ は 100 μL で ^10-5.25 であり、200 TCID₅₀/100 μL を達成するための希釈率は、200 x ^10-5.25 = ^10-2.95 = 1/10^2.95 = 1/891 の計算に基づいて 1:891
   です。

>5. MDCK-SIAT1細胞を用いたMNアッセイ

1. 1日目:血清調製とプレートレイアウトの試験と制御
   1. セラを37°Cの水浴で解凍し、解凍後すぐに取り出します。テストが必要な血清の量を分注します。シングレット中の1つのウイルスで試験するには、最低10 μLのオリジナル血清が必要です。可能であれば、血清を重複してテストします。
   2. ステップ1.12.1と同様に、56°Cの水浴中でヒト血清を30分間熱不活性化します。加熱不活化後に血清を氷上に置いて、ウイルス希釈剤を血清に添加して1:10の予希釈を達成します。
   3. RDEは、動物の血清を1:10に予め希釈して、1.12.2.
      のコントロールに使用します。 手記：解凍および処理されたヒトおよび動物の血清は、4°Cで24時間以内に保存することができます。血清は-20°Cで凍結保存するか、アッセイ前により長い保存期間が必要な場合はそれより低温で保存する必要があります。
   4. 1つのウイルスで試験するには、1:10で希釈した血清100 μL 1:10をカラムA1からA10に加えます(図3)。50 μL のウイルス希釈液を、列 11 と 12 を除く行 B から H に添加します (図 3)。A列からH列まで2倍段階希釈を行い、H列で最後の50μLを廃棄します(図3).
      手記：複数のウイルスを検査する場合は、血清を力価チューブで希釈することができます。血清の希釈は、血清力価を決定するために、ウェルAでは1:10、ウェルBでは1:20、ウェルCでは1:40、ウェルDでは1:80、ウェルEでは1:160、ウェルFでは1:320、ウェルGでは1:640、ウェルHでは1:1,280である(図3)。
   5. ウイルス制御のために、ウェルA12、B12、C12、およびD12(血清なし)に50μLのウイルス希釈剤を添加します。細胞制御のために、ウェルE12、F12、G12、およびH12(ウイルスなし、血清なし)に100μLのウイルス希釈液を加えます。
   6. コントロール血清(例えば、フェレット血清コントロール)については、希釈したコントロール血清100μLをウェルAカラム11に添加し、ウェルB11〜H11に50μLのウイルス希釈剤を添加する。シリアル希釈。
   7. プレートを覆い、ウイルス添加の準備ができるまで、37°C、5%CO₂でインキュベー
   トします。
2. 1日目:ウイルスの追加
   1. ウイルス希釈剤でウイルスを100TCID₅₀/50 μLに希釈します。
   2. バック滴定(BT)プレート上のカラム11と、すべてのプレート上の細胞コントロールウェルE12、F12、G12、およびH12を除くすべてのウェルに、希釈したウイルス50μLを添加します(図3)。カラム 11 にコントロール血清があるプレートについては、カラム 11 にウイルスを追加します。
   3. 背部滴定(BT)
      1. 重複するプレートの1セット(たとえば、プレート1Aと1B)の列11にBTを含めます。カラム11のすべてのウェルに50 μLのウイルス希釈液を添加します。100 TCID₅₀/50 μLのウイルス50 μLを最初のウェル(A11)に加えます。ピペッティングで上下に動かして混合します。
      2. 50 μLを混合して連続するウェルに移し、2倍段階希釈を行います。ウイルスの持ち越しを避けるために、ウェル間でピペットチップを交換してください。H11ウェルから50μLを廃棄します。
      3. カラム11に50 μLのウイルス希釈液を加えて、最終容量を100 μLにします。
   4. プレートを37°C、5%CO₂で1時間インキュベートします。
   5. ステップ 4.2 および 4.3 で説明されているように、1 日目に MDCK-SIAT1 細胞の添加を行い、ステップ 4.2 および 4.3 で説明されているように 2 日目に ELISA を実行します (5.3 および 5.4 でも説明されています)
3. 1日目:MDCK-SIAT1細胞の添加
   1. ステップ 4.2 の説明に従って MDCK-SIAT1 セルを調製します。100 μL MDCK-SIAT1細胞を1.5 x 10⁵細胞/mLで各ウェル(1.5 x 10⁴細胞/ウェル)に添加します。プレートを37°C、5%CO₂で18〜20時間インキュベートします。
4. 2日目:ELISA
   1. 一晩インキュベートした後、2日目に、ステップ4.3で説明したように、細胞を80%冷アセトンで固定します。
   2. 一次抗体の添加
      1. プレートを300μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。抗インフルエンザA NPモノクローナル抗体(一次抗体)を抗体希釈液中で滴定することにより決定される最適な濃度に希釈します(例:1000の目標希釈のために30mLの抗体希釈液に30μLの一次抗体を添加します)
         注:1ウェルあたり100 μLの一次抗体が必要です。1皿あたり~10mLが必要です。
      2. 希釈した一次抗体100 μLを各ウェルに加えます。室温で1時間インキュベートします。
   3. 二次抗体の添加
      1. プレートを300 μLの洗浄バッファーで3回洗浄します。HRP抗体(二次抗体)に結合したヤギ抗マウスIgGを抗体希釈液中で標的濃度に希釈します(例:標的1:4000の抗体希釈液に7.5μLの二次抗体を30mL添加します)。
         注:96ウェルあたり100 μLの二次抗体が必要です。1皿あたり~10mLが必要です。
      2. 希釈した二次抗体100 μLを各ウェルに加えます。室温で1時間インキュベートします。
   4. 基板添加とプレート読み取り
      1. プレートを300 μLの洗浄バッファーで5回洗浄し、糸くずの出ないワイプを軽くたたきます。
      2. 調製したばかりの基質100μLを各ウェルに添加し、ウイルスコントロールウェルがOD₄₉₀ = 0.8 - 3に達するまで室温でインキュベートし、細胞コントロールは低バックグラウンド_OD490 <0.2でインキュベー
      トします。
      3. 100 μLの停止溶液をすべてのウェルに加えます。マイクロプレート分光光度計を使用して、490 nmのウェルの外径を読み取ります。
5. データ分析
   手記：MNの計算は、プレートごとに個別に決定されます。
   1. 各血清サンプルの中和抗体価を測定します。
      1. 各プレートの OD₄₉₀ の 50% ウイルス中和カットオフを、次の式を使用して計算します
         
         手記：ここで、x = 中和カットオフの 50% です。カットオフ(≥50%阻害)未満のOD₄₉₀での最高希釈に対応する相互血清希釈は、その血清サンプルの中和抗体価と見なされます(図4)。
   2. 細胞制御ウェルのOD₄₉₀ <0.2、ウイルスコントロールウェルのOD₄₉₀ = 0.8 - 3があることを確認します。
   3. 各アッセイ(100x TCID₅₀)におけるウイルス感染性をウイルスBTごとに確認し、BTの許容範囲は50、100、または200 TCIDです。ステップ 4.4.2 で定義したのと同じカットオフを使用する場合、BT カラムのウイルス希釈率が最も高く、OD がカットオフを超えると、ウェル E11、F11、および G11.
      に 手記：血清陽性コントロールは、前のテストで得られた値の 2 倍以内の力価を与える必要があります。陰性の血清コントロールのOD₄₉₀は、ウイルスコントロールで観察されたものと同様であるべきです。

結果

図 1.MDCK-SIAT1細胞培養。MDCK-SIAT1細胞。(A)ウイルス接種用のMDCK-SIAT1コンフルエント単層(>100%コンフルエント)。(B)TCID₅₀およびMNアッセイのための75〜95%のコンフルエンシーを持つlogphaseのMDCK-SIAT1細胞。

図 2.TCIDプレートレイアウト。ウイルスの感染力はTCID₅₀によって決定されます。ウイルスストックを...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
高グルコースのダルベッコ修正イーグルミディアム(DMEM)	生命科学	11965	無菌細胞培養、ウイルス増殖、ウイルス希釈剤培地の重要な要素
ウシ胎児血清(FBS)	ハイクロン	03 SH30070月
ウシ血清アルブミン(BSA)フラクションV、プロターゼフリー	シグマ・アルドリッチ	3117332001
L-グルタミン	生命科学	〒25030-081
ピルビン酸ナトリウム	生命科学	11360-070
ジェネチシンG-418二硫酸塩	シグマ・アルドリッチ	A1720-5Gの
ヘープス	生命科学	15630から080
ペニシリン/ストレプトマイシン	生命科学	15140-122
アセトン	VWRの	67勝64敗1分	80%の濃度で使用
リン酸塩-クエン酸緩衝液と過ホウ酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	SLBF2806V
O-フェニレンジアミン二塩酸塩錠	シグマ・アルドリッチ	SLBQ1086V	細胞培養グレードの水100mlあたり1錠
硫酸	フィッシャーサイエンティフィック	A510-P500	使用済み0.5M最終濃度
エタノール、変性、4L	VWRの	EM-AX0422-3	70%の濃度で使用
トリプシン-EDTA	生命科学	1748048
RDE II「聖剣」	デンカ聖ケン	370013
トゥイーン 20	シグマ・アルドリッチ	1379-500ミリリットル
抗NPマウスモノクローナル抗体	ミリポアプール	MAB 8257 MAB 8258
抗マウスIgG HRP	KPLの	〒074-1802
96ウェルフラットボトムプレート	サーモサイエンティフィック	3455
プレートリーダー	分子デバイス	スペクトロマックス384プラス
細胞培養フラスコ 162 cm2/ベントキャップ	コーニング/VWR	3151

年 名 名