シロイヌナズナの葉板における免疫誘発時の酸化的バーストを検出するためのアッセイ

要約

出典:Bredow, M., et al. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2019)

このビデオは、免疫誘発時のシロイヌナズナの葉の酸化バーストを測定するアッセイを示しています。植物の葉から切り出された葉盤は、微生物関連分子パターンまたはMAMPとして機能する細菌ペプチドとインキュベートされます。MAMPが検出されると、植物細胞は細胞外ROSの産生を誘導し、これは化学発光アッセイを使用して検出されます。

プロトコル

1. シロイヌナズナの免疫誘発後の椎間板におけるROSバーストの検出

1. 植物の成長と維持。
   1. 発芽を同期させるには、シロイヌナズナの種子を1 mLの滅菌0.1%寒天[w / v]に約50個の種子を懸濁して層状にし、4°C(光なし)で3〜4日間保存します
      手記：野生型のバックグラウンドコントロール(Col-0など)と、免疫出力が高い遺伝子型と低い遺伝子型(cpk28-1やbak1-5など)を層別化して、内部コントロールとして使用します。
   2. 土壌に種子を蒔き、標準的な短日条件(22°C、10時間の光、150μE / m² / sの光強度、および65〜70%の相対湿度)で発芽させます。
   3. 約7日後、鉗子を使用して個々の苗木を新しい鉢に移植し、少なくとも4 cm離れて、完全なロゼットの発育を可能にします。遺伝子型ごとに6〜12本の苗木を移植し、標準的な短日条件に戻します。定期的に植物に水をやり、肥料を与えます(1週間ごとに20-20-20肥料の2g / L)。
2. 葉のディスクを96ウェルプレートに集めて、一晩で回収します。
   1. 発芽後4〜5週間(図1A)で、鋭い4 mm生検パンチを使用して、植物ごとに1つの葉盤を取り外し、中静脈を避け、傷を制限するように注意します(図1B)。乾燥を防ぐために、100 μLの二重蒸留水(ddH₂O)が入った未使用の96ウェルルミノメータープレートに葉ディスクを置き、同軸側を上に向けてください(図1C)。複数のエリシターを評価する場合は、エリシター処理ごとに同じリーフから1枚のリーフディスクを取り出します。
      手記：ロゼットの上部から 3 番目から 5 番目に完全に拡張され、ばらつきを制限するためにほぼ同じサイズと年齢の葉をサンプリングします。可能であれば、一晩で回収する前に、カミソリの刃を使用して葉の円盤を半分に切ります。
   2. 葉の円盤収集中に傷によって生成されるROSの干渉を防ぐために、室温で一晩回復します。蒸発を防ぐためにプレートを蓋で覆います。
3. エリシター処理を行い、ROS産生を測定します。
   1. 反応溶液を添加する前にプレートリーダーをプログラムすると、ROSバーストの開始から最初の測定が記録されるまでの時間が短縮されます。プレートリーダーに適した市販のソフトウェアを使用してください。この場合 (目次を参照)、[設定] をクリックし、[LUM96 カートリッジ] と [キネティック読み取りタイプ] を選択します。「読み取り領域」カテゴリをクリックし、ドラッグして、読み取るウェルのサブセットまたはプレート全体を選択します。[PMT and Optics] タブで、積分時間を 1,000 ミリ秒に設定します。[タイミング] タブで、[合計実行時間] を 40-60 分に設定し、[インターバル] を 2 分に設定します。
   2. マルチチャンネルピペットを使用して各井戸から水を取り除きます.
      手記： リーフディスクに穴を開けると、傷害ストレスが発生し、ROS出力がより変動する可能性があるため、穴を開けないでください。
   3. 100 μM ルミノール、10 μg/mL 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)、および所望濃度のエリシター (例: 1 nM、10 nM、100 nM、または 1,000 nM) を滅菌 ddH₂O に含有する反応溶液を、1 つの 96 ウェルプレート 10 mL 溶液 10 mL を使用して調製します。
      手記： 凍結乾燥ペプチドを低結合チューブの滅菌H₂Oに溶解して10 mMストックを調製し、液体N₂で瞬間凍結し、-80°Cで保存します。使用する準備ができたら、ストックを滅菌H₂Oで希釈して100 μMのワーキングストックを生成し、-20°Cで保存します。
   4. マルチチャンネルピペットを使用して、100 μLの反応混合物を各ウェルに分注し、同じ処理のすべてのリーフディスクに同時に溶液を加えます。誘発がない場合の基礎ROSレベルを評価するために、各遺伝子型の対照反応(エリシターなし)を含めます。マイクロプレートリーダーを使用して、可視スペクトルのすべての波長の発光を即座に測定します.
      手記： ルミノールとHRPは光感受性試薬であるため、反応溶液を低照度下で調製して適用します。使用時以外は、試薬を氷上または-20°Cに保管してください。
   5. マイクロプレートリーダーで40〜60分間隔で2分間隔で1,000msの積分時間で発光を測定し、動的酸化バーストを捕捉します(図1D).
      手記：より長い積分時間を使用してアッセイ感度を向上させると同時に、96ウェルプレート内のすべてのサンプルを1つの間隔で測定できるようにします。

結果

図 1.シロイヌナズナにおける免疫誘導後のルミノールベースの酸化的バーストアッセイ。(A)4〜5週間、短日条件で土壌に植物を育てます。(B)4 mmの生検パンチを使用して、各植物から葉の円盤を採取し、ddH2Oで一晩回復します。(C)反応溶液(100μMルミノール、10μg/mL HRP、および所望濃度のエリシタ)を添加し、40〜60分間にわたって、2分間隔で1,000msの積分時間で発光を測定する。 bak1-5(オレンジ色で表示)などの低ROS制御。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
20-20-20 肥料	プラント製品	10529	1g / Lを水に混ぜて、最適な成長のために2週間ごとに植物に塗布します。
4mm生検パンチ	メディカルマート	232-33-34-P	表面積が0.125cm^2のコルクボーラーセットも使用できます。
BioHit mLine メカニカル 12 マルチチャンネルピペット (30-300 uL)	ザルトリウス	725240	任意のマルチチャンネルピペットを使用でき、必要に応じて1つのピペットも使用できます。
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZバイオラボ	CP7211	10 mMストックペプチドを-80°Cで低タンパク質結合チューブに保存します。解凍後、100μMの作業用ストックを-20°Cで保管します。
鉗子	フィッシャーサイエンティフィック	22-327379
西洋わさびペルオキシダーゼ	シグマ・アルドリッチ	P6782	純水に溶かします。-20°Cで、光を避けて保管してください。
ルミノール	シグマ・アルドリッチ	A8511	DMSOに溶解します。-20°Cで、光を避けて保管してください。
MurisageとSkoogの基礎塩	シダーレーンラボ	MSP09-100LT	4Cで保管します。
土	SunGrow園芸	サンシャインミックス#1	他の土壌タイプもシロイヌナズナの栽培に使用できます。鍋に水を入れるときは水と混ぜてください。
SpectraMax Paradigm マルチモードマイクロプレートリーダー (LUM モジュール付き	分子デバイス		これらのアッセイには、発光を検出できるプレートリーダーであれば、どれでも使用できます。
ホワイトポリスチレン96ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-589

型 の ) (代表)