免疫誘発性実生成長阻害の測定

要約

出典:Bredow, M. et al., Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147),(2019).

このビデオは、シロイヌナズナ植物の実生成長阻害アッセイを示しています。免疫ペプチドエリシターの濃度の増加が苗の成長に与える影響が決定されます。

プロトコル

1. 実生成長阻害アッセイ

1. 種子を滅菌し、ムラシゲプレートとスクーグ(MS)プレートに播種します。
   1. 0.8% 寒天 [w/v] を含む無菌半強度 (0.5x) MS 培地 (2.16 g/L) を調製します。層流フード内のプレート(90 x 15 mm)にメディアを注ぎます。
   2. 70%エタノール1mLで2分間洗浄し、微量遠心チューブ内で約100個の種子を滅菌し、吸引して除去します。40%漂白剤1mLを加え、室温で17分間静かに振とうします。漂白剤を吸引して除去し、滅菌水1mLで5分間3回洗浄します。滅菌0.1%寒天培地1mLに再懸濁
      手記：あるいは、塩素ガス種子滅菌プロトコル24を使用する。
   3. ピペットを使用してMS寒天プレートに遺伝子型ごとに約100個の種子を播種し、層流フード内のマイクロポアテープでシールします
      手記：種子を近くに置くと、後で苗を移植するのが難しくなるため、避けてください。
   4. プレートを4°C(光なし)に3〜4日間置いて種子を層状にし、発芽を同期させます(図1A)。
2. 免疫エリシターペプチドを含む48ウェルプレートに苗を移植します。
   1. 成層後、プレートを短日条件(22°C、10時間光、150μE / m² / s光強度、および65〜70%相対湿度)で3〜4日間光に動かし、発芽させます。
   2. 層流フードで、1% スクロース[w/v]を含む滅菌 0.5x MS 液体培地で、48 ウェルプレートごとに 25 mL の MS を使用して、エリシターペプチド希釈液(0 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1,000 nM)を調製します。ウェルあたり500 μLのMS液体培地またはペプチドを含むMS培地をピペッティングしてプレートを調製します。可能な場合は、プレート調製にリピートピペッターを使用してプロセスを迅速化します.
      手記：各遺伝子型について、エリサイターなしでMSで苗を育て、苗の成長に固有の違いを考慮します。
   3. 滅菌鉗子を使用して、同じサイズと年齢の各ウェルに1本の苗を慎重に移植し、苗の損傷や根の破損がなく、根が培地に沈んでいることを確認します。各遺伝子型について、各ペプチド希釈液に最低6〜8本の苗木を移植します(図1B).
      手記： 発芽後4日で苗を移植します、短い根は操作しやすく、古い苗は最適な結果をもたらす可能性があるためです。
   4. プレートをマイクロポアテープでシールし、標準的な短日条件(22°C、10時間の光、150μE/m²/sの光強度、65-70%の相対湿度)で光に戻します。苗木が8〜12日間成長するのを待ちます。

2. 成長阻害率を決定します。

1. 48ウェルプレートから苗を慎重に取り出し、ペーパータオルで軽くたたいて乾かします。分析スケールで苗の重さを量り、値を記録します。可能な場合は、USB出力を備えた分析スケールを使用して、スプレッドシートに新しい重量値を記録します。苗の重量を量る前に、成長阻害を視覚的に示すための写真を撮ります(図1C)。
2. エリシター処理された苗木とMSで育てられた苗木の比較で、次のようにのみ成長阻害率を決定します:
   
3. 標準誤差バー付きの棒グラフを使用するか、ボックスアンドウィカープロットを使用してデータをプロットし、実験間の分散をより適切に表示します。

結果

図 1.シロイヌナズナにおけるエリシター誘導性実生成長阻害アッセイ。(A)MS寒天に苗を播種し、標準的な短日条件下で3〜4日間成長させます。(B)MS培地または異なる濃度のelf18を含むMSを含む48ウェルプレートに苗木を移植します。(C)8〜12日後、苗のサイズを視覚的に評価し、分析スケールを使用して新鮮な重量を測定し、成長阻害率を決定します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
蓋付き8ウェル滅菌プレート	シグマ・アルドリッチ	CLS3548
ドラフトシェイド付き分析スケール	VWRの	VWR-225ACの	成長イニビションアッセイには、標準的な分析スケールであればどのようなものでも使用できますが、直接コンピューターアウトプットが最適です。
BioHit mLine Mechanical 12 マルチチャンネルピペット (30-300 uL	ザルトリウス	725240	任意のマルチチャンネルピペットを使用でき、必要に応じて1つのピペットも使用できます。
elf18 (AcSKEKFERTKPHVNVGTIG)	EZバイオラボ	CP7211	10 mMストックペプチドを-80°Cで低タンパク質結合チューブに保存します。解凍後、100μMの作業用ストックを-20°Cで保存します。
MurisageとSkoogの基礎塩	シダーレーンラボ	MSP09-100LT	4°Cで保管してください。
ホワイトポリスチレン96ウェルプレート	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-589

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