単球単分子膜におけるFcγ受容体駆動型食作用の研究のためのアッセイ

要約

出典: Tong, T. N., et al. Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fcγ Receptor-mediated Phagocytosis. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、末梢血の初代単球を利用して、ポリD抗体オプソニン化R₂R₂赤血球によるFcγ受容体媒介性食作用を評価する単球単層アッセイを紹介しています。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 末梢血単核細胞の単離

1. 健康なドナーまたは患者から、酸性-クエン酸-デキストロース(ACD)抗凝固剤(イエロートップチューブ)を含むバキュメンナーを使用して静脈穿刺を介してヒト全血を採取します。
   手記：全血は、次のステップに進む前に、室温(18-22°C)で最大36時間ACDに保存できます。通常、アッセイには全血の10 mLバキュテイナーチューブ1〜2本で十分です。
2. 温かい完全RPMI培地(RPMI-1640に10%ウシ胎児血清、20 mM HEPES、および0.01 mg / mLゲンタマイシンを添加)で全血を1:1 v / vで希釈します。.
3. 製造業者が推奨する密度勾配遠心分離法を用いて、希釈した全血から末梢血単核細胞(PBMC)を単離します(材料リストを参照)。希釈した血液を密度勾配(室温、18-22°Cまで温めた)上で非常にゆっくりと層状にします。
   手記：血液を最適に分離するために、界面での混合量を最小限に抑えるには、血液混合物を滴下またはピペットを使用して慎重に重ねます。
   1. ピペットの先端を密度勾配の近くに置き、血液混合物がチューブの側面を非常にゆっくりと流れ落ちるようにすることで、血液混合物が密度勾配の上部にゆっくりと重なるようにします。
   2. 実験の規模に応じて、3 mLの密度勾配(15 mLチューブ内)の上に10 mLの血液混合物を重ねるか、15 mLの密度勾配(50 mLチューブ内)の上に35 mLの血液混合物を重ねます。通常、10 mLの全血は1,000万個のPBMCを産出しますが、ドナーごとに多少のばらつきがあります
      手記：血液混合物と密度勾配が混ざっていないことが非常に重要です。血液混合物は密度勾配の上に重なり、すべての血液が密度勾配の上に来るまでゆっくりと上昇する必要があります。
   3. 層状混合物を700 x gで30分間、ブレーキなしで遠心分離します。遠心分離した混合物は、血漿、バフィーコート(PBMCを含む)、密度勾配材料、顆粒球、およびRBCの5つの層(上から下へ)に分離する必要があります。
   4. 血漿の大部分を取り出して廃棄し、パスツールピペットと吸引バルブを使用して、バフィーコート(PBMC)の内容物を新しい15mLチューブに慎重に回収します><。 手記： バフィーコート層の除去は、ピペットの先端をチューブに当てて、層の外側を円を描くように動きながら、パスツールピペットに吸引を加えることによって効果的に行われます。
4. 分離したPBMCをpH 7.3リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で350 x gで10分間(フルブレーキ付き)遠心分離することにより、洗浄の合間に3回洗浄します。PBMCペレットを完全なRPMI媒体で再構成します。ペレットのサイズにもよりますが、3〜7mLの培地で十分です。
5. トリパンブルーと血球計算盤を使用してPBMCを数えます。トリパンブルーで染色されていない細胞のみをカウントします。完全なRPMI培地でPBMCを1,750,000細胞/mLに再構成します。
6. 400 μL(700,000細胞)を8チャンバースライドの各ウェルに播種します。スライドを37°Cの完全加湿組織培養インキュベーター(5% CO₂を添加)で1時間インキュベートし、単球/マクロファージが付着
することを確認します。

2. 付着単球の前処理

>注:この手順は、食作用を阻害または強化する方法を探している場合にのみ必要です。

1. 付着した単球を、目的の薬物または化合物で前処理します。完全なRPMI培地を使用して、薬物またはその他の試験材料を希望の濃度に再構成します。
   手記：例えば、ヒト単球を使用すると、通常、200 μg/mLのIVIGを使用して、食作用を95〜100%
阻害します。
2. 1-hインキュベーション後(ステップ1.6後)に、非接着性細胞を含む上清を8チャンバースライドから吸引して廃棄します。400 μLの薬剤または他の処理薬と交換し、37°Cで1時間インキュベートします。
   1. 8チャンバースライドで溶液を吸引して交換するときは、接着が弱い細胞が浮き上がらないように、流体の流れを制御してください。また、一度に2〜3個の空の井戸のみで作業し、井戸の乾燥を避けてください
      手記：通常、各治療は技術的なトリプリケートで行われます。

3. R₂R₂赤血球のオプソニン化

>注:オプソナイズされたR₂R₂ RBCは、FcγR媒介性食作用のポジティブコントロールとして使用されます。ナイーブR₂R₂は、4°Cで最大1ヶ月間、Alseverの溶液に保存する必要があります(保存期間を延ばすため)。Alseverのソリューションは社内で製造され、0.8% w / vクエン酸三ナトリウム(二水和物)、1.9% w / vデキストロース、0.42% w / v塩化ナトリウム、および0.05% w / vクエン酸(一水和物)で構成されています。_R2R2細胞が利用できない場合、_R1R2、R1R1、_R1r、または_R2rなどの他のRh表現型細胞を使用することができる。

1. PBS中の_R2R2(cDE/cDE)赤血球を350 x gの遠心分離法を用いて計3回、各5分間洗浄する
   手記： 必要な赤血球の量は実験サイズによって異なり、逆算することができます。RBCは、溶解による各洗浄中または上清の除去中に失われるため、常に過剰な量のRBCを洗浄してください。たとえば、5つの処理と2つのコントロールを全てテクニカルトリプリケートで実施する実験では、合計21のウェルがあります。1.25% RBC混合物の400 μL/ウェルを含む 21 ウェルは、105 μL の充填されたオプソニン化 RBC が必要であることを示しています。200 μLのRBCを最初に洗浄し、150 μLをオプソニン化して、食作用ステップに十分な量のRBCがあることを確認する必要があります。
2. 洗浄したR₂R₂ペレットをヒト血清由来の1:1 v/vポリクローナル抗D抗体でオプソナイズし、断続的に混合しながら37°Cで1時間インキュベートします
   手記： ポリクローナル抗D抗体が入手できない場合は、市販のモノクローナル抗D抗体や、血液銀行や輸血サービスで入手できるRh免疫予防に通常使用される抗D抗体を使用することが可能です。最適化試験は、アッセイのセットアップ開始時、および多くの非力価ポリクローナル抗体を切り替えたり、モノクローナル抗体に切り替えたりするたびに実施する必要があります。これは、抗グロブリン試験 (IAT) の結果が 3+ から 4+ で、貪食結果が 100 個の単球あたり 70 から 90 の食作用 RBC に必要な抗 D の最適な濃度または量を特定するためです。
3. オプソニン化したR₂R₂をPBSで合計3回、350 x gで遠心分離し、それぞれ5分間洗浄します
   手記：R2R2のオプソニン化の成功は、間接IATを行うことによって確認することができる。簡単に言うと、二次ポリクローナル抗ヒト抗体を添加して、赤血球表面上の一次オプソナイジング抗体に結合させ、増幅されたシグナルを赤血球凝集の形で観察することができます。詳細なメーカープロトコルは、補足資料ファイルに記載されています。
4. 洗浄したR₂R₂ペレットを完全なRPMI培地を使用して1.25% v / vに再構成します
   手記：過剰なオプソニン化R₂R₂は、アルセバーの溶液中4°Cで最大1週間保存できます。

4. Fc受容体介在性食作用

1. 8チャンバースライドから薬物または培地の上清を吸引し、1.25%v / v R₂R₂混合物を400μL加えます。37°Cで2時間インキュベートします。
2. インキュベーションの2時間後、メーカーのアダプターを使用してチャンバーを取り外してください。余分なR₂R₂をペーパータオルで軽くたたきます。スライドが乾かないように注意してください。
3. 100mLのビーカーにPBSを入れます。スライドをゆっくりと前後に動かして(約30〜40ストローク)、スライドを沈めて洗浄し、未食作用のある_R2R2の大部分を取り除きます。
4. PBSからスライドを取り外します。ペーパータオルまたはティッシュを使用して余分なPBSを軽くたたき、スライドを風乾します。
5. 風乾スライドを100%メタノールで45秒間固定します。次に、固定スライドを風乾します.
   手記：スライドは、Grünwald-Giemsa染色21やWright-Gimsa染色など、ダウンストリーム染色により適合する別の方法を使用して固定できます。
6. 自社製のElvanol封入剤(または他の市販の封入剤)を使用してスライドを取り付け、カバースリップを追加します.
   手記：エルバノール封入剤は、PBS中の15%w/vポリビニルアルコール樹脂と30%v/vグリセリンで構成されています。混合物は、すべての樹脂が溶解し、グリセリンが均一に混合されるまで加熱されます。これは、他の市販の封入剤と交換することができます。
7. 定量化する前に、マウントを一晩乾燥させます。

5. 食作用の定量化

1. 位相差顕微鏡と40倍対物レンズを使用して、少なくとも200個の単球とこれらの単球内の食作用のあるR₂R₂の数をカウントすることにより、食作用イベントの量を手動で定量化します。片球の数と食作用のある_R2R2の数を同時に定量するために、各手に1つのカウンターがあります。
2. 食作用のある_R2R2の数を単球の数で割って100を掛けることにより、平均食作用指数を取得します。データを平均(平均食作用指数)±平均の標準誤差(SEM)として表します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
RPMIの1640	RPMIの1640	R8758
リン酸緩衝生理食塩水	シグマ	D8537
8チャンバースライド	Lab-Tek-ll	154534
R2R2(cDE/cDE)赤血球			市販品(例:http:// www.bio-rad.com/en-ca/product/ 試薬赤血球)
ヒト血清由来のポリクローナル抗D	ガンマバイオロジクス	DINの02247724	市販のモノクローナル抗D薬またはRh免疫グロブリンで代用可能
メタノール100%	カレドン	6700*1-42
カバースリップ	VWRの	48366 067