フローサイトメトリーによる気管支肺胞洗浄液中の免疫細胞の同定と列挙

要約

出典:Van Hoecke, L. et al., 炎症性細胞浸潤を分析するためのマウス肺の気管支肺胞洗浄。J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、気管支肺胞洗浄液中のさまざまな免疫細胞を同定し、カウントするためのフローサイトメトリーの使用を実演しています。まず、生存率色素を用いて単一の免疫細胞を同定し、続いて表面マーカータンパク質の鑑別染色を行うことで、各細胞タイプの正確な列挙が可能になります。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 準備

1. 洗浄液
   1. 100 μMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)
      で平衡塩溶液を調製します。 手記：気管支肺胞洗浄液中のタンパク質レベルを測定するには、BAL液中のプロテアーゼ活性を防ぐためにプロテアーゼ阻害剤を追加することをお勧めします。
2. カテーテル
   1. 透明なプラスチックポリエチレン製の21Gチューブ(内径0.58mm、外径0.965mm、長さ0.5cm)に23Gの針を差し込んでカテーテルを作製します。既製のカテーテルも使用できます。
3. 麻酔 薬
   1. 終末麻酔薬、できれば呼吸停止を引き起こす麻酔薬を準備します(例:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のペントバルビタールナトリウム(>100 mg / kg)溶液のようなバルビツール酸塩)。
      手記：吸入麻酔はBAL液量に影響を与える可能性があるため、吸入麻酔の代わりに注射麻酔を使用することをお勧めします。例えば、CO₂は血液のpHに影響を与え、その結果、さまざまな化合物の再分布に影響を与えます。
4. アンモニウム-塩化カリウム(ACK)赤血球溶解バッファー
   1. 8.29 g の塩化アンモニウム (NH₄Cl) と 1 g の重炭酸カリウム (KHCO₃) を 1 L の H₂O に 100 μM EDTA で溶解して、ACK 溶解バッファーを調製します。赤血球溶解バッファーは、外部から購入することもできます。

2. 気管支肺胞洗浄術(BAL)の実施

1. カテーテルを気管に導入する
   1. 26Gの針を使用して、致死量の短時間作用型バルビツール酸麻酔薬の腹腔内注射によりマウスを安楽死させます。適切な致死麻酔を確認するには、マウスの後足を鉗子でつまんで足の反射を確認します。
   2. 動物を手術用プレートに仰向けに置き、手足を固定してマウスを固定します。
   3. 首に70%エタノールをスプレーして消毒します。メスを使用して気管近くの首の皮膚を切開します。
   4. 皮膚を開いて唾液腺を露出させます。胸骨舌骨筋を露出させるためにはさみを使用して唾液腺を分離します。はさみを使用して気管の周りの筋肉を切開し、気管を露出させます。
   5. はさみを使用して気管の下に綿糸を置きます。
   6. 26Gの針で2つの軟骨リングの間の露出した気管の中央を慎重に穿刺します。気管をこれ以上傷つけないように注意してください。
   7. カテーテルを気管に約0.5cm挿入します。カテーテルが気管の奥深くに挿入されすぎないようにしてください。
   8. ステップ2.1.5で配置した綿糸を使用してカテーテルの周りに気管を結び、カテーテルを安定させます。カテーテルが十分に結ばれていない場合、注入されたバランスの取れた塩溶液は、肺に流れ込むのではなく、気道の上部に向かって流れる可能性があります。
2. 洗濯液を集める
   1. 1 mLシリンジに1 mLの滅菌平衡塩溶液(100 μM EDTAを含む)をロードします。
   2. 1 mLシリンジをカテーテルに接続し、塩/ EDTA溶液を肺に穏やかに注入します。.
   3. マウスの胸部をマッサージしながら、溶液を穏やかに吸引します。吸引液がシリンジに表示されない場合は、カテーテルを気管の少し下または上に慎重に挿入します。
   4. 注射器を針から取り出し、回収した洗浄液を氷の上に置いた15mLチューブに移します。.通常、注入した溶液1mLから700〜900μLのBALを回収します。
   5. 手順 2.2.1 から 2.2.4 をさらに 2 回繰り返します。
      手記：非細胞含有量の分析が目的である場合、感度に問題がある場合は、プールしたサンプルを濃縮することをお勧めします。

3. BAL液の細胞成分と非細胞成分の収集

1. 洗浄液を400 x g、4°Cで7分間遠心分離します。
2. 上清を採取し、すぐにさらなる分析(酵素結合免疫吸着アッセイ、ELISAなど)に使用するか、-80°Cで凍結します。
3. 細胞ペレットを200 μLのACK溶解バッファーに再懸濁します。
   手記：このステップにより、白血球を無傷に保ちながら、赤血球の溶解が保証されます。
4. 室温で2分間インキュベートします
   手記：赤血球溶解による変動を減らすために、このステップは2分以上実行しないでください。
5. 1 mLの冷PBSを加えて、ACK溶解バッファーを希釈します。
6. 400 x g、4°Cで7分間遠心分離し、上清を捨て、下流の分析のために細胞を適切な量のPBSに再懸濁します(下記参照)
   手記：PBS の量は、実施される下流の研究によって異なります。

>4. フローサイトメトリーによるBAL液中の細胞種の解析

>注:1つの可能性は、フローサイトメトリーを行うことにより、BAL流体の絶対的および相対的な細胞組成を分析することです。この論文の目標は、BALの技術について詳しく説明することです。フローサイトメトリーは、それ自体が特殊な技術です。フローサイトメトリー技術に関する専門論文を読むことをお勧めします。特定の細胞タイプに特異的な表面抗原(表1を参照)を認識する蛍光色素に結合した抗体が使用されます。ゲーティング戦略を用いることにより、BALの細胞画分中のT細胞、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、好酸球、および好中球を同定することが可能です。

1. 細胞表面染色
   手記：フローサイトメトリー解析に必要なすべての重要なコントロールを含めることが重要です。3セットのチューブが必要です(表2を参照):(1)サンプルを含むチューブ。(2)各抗体-蛍光色素にBAL細胞を充填したチューブで、単一の染色を行います。これにより、フローサイトメーターの各チャンネルの電圧を決定できます。(3)各抗体-蛍光色素にビーズを付けたチューブを使用して、単一の染色を行います。これは、補正マトリックスを決定するためのものです。
   1. 抗体とFc-block(抗CD16/CD32)をPBS中に適切な希釈液で混合します(表2参照)。実験前に、各抗体の最適な使用希釈率を決定する必要があります。
   2. サンプル用の抗体混合物50 μLに細胞を再懸濁し、適切に希釈した抗体50 μLをクリティカルコントロールに加えます
      手記：染色は、96ウェルのU字型プレートで行うことができます。これにより、染色量を簡単に減らし、大量のサンプルを分析することが可能になります。
   3. 暗所4°Cで30分間インキュベートします。
   4. 400 x g、4°Cで7分間遠心分離し、上清を捨てます。
   5. PBS中の細胞を最終容量200 μL.
      に再懸濁します。 手記：この最終的な容量は、フローサイトメーターがアクセスできる最小容量によって異なります。これは、マシンによって若干異なる場合があります。さらに、読み取り量は、細胞数やサンプルがフローサイトメーターで泳ぐのにかかる時間によって異なります。
   6. フローサイトメトリー解析用のサンプルとコントロールを使用してください.
      手記：異なる細胞集団の絶対細胞数を決定するには、計数ビーズを追加する必要があります。測定直前に、各サンプルに同数のビーズ(±25,000個のビーズ)を追加します。前方散乱光と側方散乱光を使用することにより、カウントビーズをフローサイトメトリーで同定できます(図1を参照)。その後、ビーズイベントと細胞イベントの比率を比較することにより、サンプル中の細胞の絶対数を計算できます。次の式を使用できます:
      
2. フローサイトメトリー解析
   手記：フローサイトメトリー解析は、染色プロトコルの完了直後に行う必要があります。シグナル検出に適したレーザーとフィルターを備えたフローサイトメーターを使用する必要があります。表3は、この原稿で説明した研究に必要なレーザーとフィルターの概要を示しています。フローサイトメトリー解析の詳細については、Adan et al.を参照してください。
   1. 一次ゲートは、破片とダブレットを除く前方散乱と側面散乱に基づいて設定します(図1を参照)。
   2. 電圧とスペクトルのオーバーラップの補正を、単一染色した細胞とビーズの助けを借りて調整します。
      手記：これらの設定はフローサイトメーターごとに異なるため、各実験の前に確認する必要があります。正しい流量解析のためには、順方向散乱電圧と側方散乱光電圧が重要です。正しい前方散乱光と側方散乱光は、分析された細胞の同一性の同定と確認に役立ちます。これらの電圧を測定するには、まず未染色のサンプルを分析する必要があります。
   3. 表面抗原の蛍光ゲートを設定し(図1を参照)、サンプルを分析します。

表 1: 免疫細胞表面抗原の選択。この表は、さまざまな細胞タイプを特徴付けるために使用される表面エピトープのリストを示しています。特定の細胞タイプを確実に定義するには、いくつかのマーカーの組み合わせが必要になります。

の

抗原	細胞の種類
分化クラスター3(CD3)	T細胞で発現
分化クラスター 11c (CD11c)	ほとんどの樹状細胞だけでなく、単球、マクロファージ、好中球、および一部のB細胞でも高発現します。
分化クラスター11b(CD11b)	単球、好中球、ナチュラルキラー細胞、顆粒球、マクロファージなど、多くの白血球の表面に発現します。
シグレックF	肺胞マクロファージと好酸球。
MHCIIの	通常、樹状細胞、単核食細胞、B細胞などの抗原提示細胞にのみ見られます。
CD19	Bリンパ球抗原
Ly-6G(ライ-6G)	単球、顆粒球、好中球のマーカー

>表 2.含めるコントロールのリスト。この表は、取得した結果を正確に解釈するために必要なすべてのコントロールを示しています。

名 名 名 名 名 の 名 名 名 名 名 名 名 名 名 の 名 名 名 名 名 名 名 名 の 名 名 名

サンプル
管	細胞に添加する抗原フルオロフォア	抗体ストック濃度(mg / mL)	抗体希釈	総容量 (μL)
	固定可能な生存率色素	0.2	1/1000	50
	CD11c	0.2	1/800	50
	シグレックF	0.2	1/100	50
サンプルX	MHCIIの	0.2	1/200	50
	CD3	0.2	1/200	50
	CD19	0.2	1/200	50
	CD11bの	0.2	1/200	50
	ライ6G	0.2	1/200	50
電圧制御
管	細胞に添加する抗原フルオロフォア	抗体ストック濃度(mg / mL)	抗体希釈	総容量 (μL)
未染色細胞	/	/	/	50
単一染色細胞	固定可能な生存率色素	0.2	1/1000	50
単一染色細胞	CD11c	0.2	1/800	50
単一染色細胞	シグレックF	0.2	1/100	50
単一染色細胞	MHCIIの	0.2	1/200	50
単一染色細胞	CD3	0.2	1/200	50
単一染色細胞	CD19	0.2	1/200	50
単一染色細胞	CD11bの	0.2	1/200	50
単一染色細胞	ライ6G	0.2	1/200	50
補正制御
管	ビーズに添加する抗原フルオロフォア	抗体ストック濃度(mg / mL)	抗体希釈	総容量 (μL)
染色されていないビーズ	/	/	/	200
シングルステンドビーズ	CD11c	0.2	2000/1	200
シングルステンドビーズ	シグレックF	0.2	2000/1	200
シングルステンドビーズ	MHCIIの	0.2	1/200	200
シングルステンドビーズ	CD3	0.2	2000/1	200
シングルステンドビーズ	CD19	0.2	2000/1	200
シングルステンドビーズ	CD11bの	0.2	1/400	200
シングルステンドビーズ	ライ6G	0.2	1/200	200

>表3:この研究で使用したフローサイトメーターのレーザーとフィルターの概要。

レーザータイプ	フィルターのセットアップ
	505 LPレコード	525/50
ブルー(488 nm)	550 LPレコード	575/26
100 mW	670 LPの	685/35
	750 LPの	780/60
バイオレット 405nm		450/50
100 mW
赤色 633nm		660/20
70 mW	750 LPの	780/60

結果

図1:BAL液中のマクロファージ、樹状細胞、T細胞、B細胞、好中球、および好酸球のフローサイトメトリー検出のためのゲーティング戦略。 BAL細胞は、記載されたBALプロトコルを用いて単離した。細胞は、リポ多糖類の気管内注入の24時間後にマウスから単離されました。カウントビーズと細胞は、前方散乱光と側方散乱光の特性に基づいて同定されました。セルゲートでは、前方散乱散乱および側方散乱を用いて単一細胞を同定しました。この最後の集団では、生きていた細胞が同定されました。次に、CD11c^高細胞およびCD11c^低細胞を同定した。CD11c^高集団では、樹状細胞とマクロファージがそれぞれMHCIIとSiglecFの発現に基づいて同定されました。CD11c^低集団では、CD3εとCD19の発現に基づいてT細胞とB細胞がそれぞれ同...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バランスの取れた塩溶液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14175から129
エチレンジアミンテトラ酢酸	シグマ・アルドリッチ	E6511	もどかしい
23G x 1 1/4 針	ヘンケ・サス・ウルフ	4710006030	サイズ:0,60 x 30 mm
26G x 1/2 ニールデ	ヘンケ・サス・ウルフ	4710004512	サイズ:0,45 * 12 mm
プラスチックチューブ	BDメディカルテクノロジー	427411	ポリエチレンチューブ、内径0.58 mm(.023インチ)OD。965 mm(0.38インチ)30.5m(100フィート)
ペントバルビタールナトリウム	ケラNV	514
リン酸緩衝生理食塩水	ロンザ	BE17-516F	Ca++ Mg++またはフェノールレッドを含まないPBS;滅菌ろ過済み
1mlシリンジ	ヘンケ・サス・ウルフ	5010.200V0	非発熱性および非毒性
鉗子	ファインサイエンスツールズ社	91197から00
手術用ハサミ	ファインサイエンスツールズ社	91460から11
遠心分離チューブ50 ml	番目。ガイヤー	7696705	Rnase/Dnase/エンドトキシンを含まない
遠心分離管15 ml	番目。ガイヤー	7696702	Rnase/Dnase/エンドトキシンを含まない
マイクロ遠心チューブ1,5 ml	シグマ・アルドリッチ	0030 120.094	ポリプロピレン
マイクロ遠心分離機	シグマ・アルドリッチ	5415Rの
遠心機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75004030
塩化アンモニウム-カリウム(ACK)溶解バッファー	ロンザ	10-548E	滅菌ろ過
ライブ/デッド-efluor506	eバイオサイエンス	〒65-0866-18	固定可能な生存率色素
CD11c-PE-cy7	eバイオサイエンス	〒25-0114-81
シグレックF-PE	BDファーミンゲン	552126
MHCII-APCefluor780	バイオレジェンド	107628
CD3-PE-cy5	VWRの	〒55-0031-U100
CD19-PE-cy5	eバイオサイエンス	15-0193-83
CD11b - V450	BDファーミンゲン	560455
ライ6G-AF700	バイオレジェンド	127621
アブソリュートカウンティングビーズ	ライフテクノロジーズヨーロッパB.V.	C36950
抗CD16/CD32	BDファーミンゲン	553142
96ウェル340μLストレージプレートプレート	隼	353263	V字型、天然ポリプロピレン
フローサイトメーター	BDバイオサイエンス
カテーテル	BDバイオサイエンス	393202

名 の