マイコバクテリアに対する試験化合物活性を評価するための木炭寒天レサズリンアッセイ

要約

出典: Gold, B. et al., Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、結核菌に対する抗菌化合物の活性を評価するためのCharcoal Agar Resazurin Assay(CARA)を紹介しています。CARAは、これらの化合物が細菌の増殖に及ぼす影響を測定し、殺菌効果と静菌効果を区別することで、これらの化合物の有効性を評価するのに役立ちます。

プロトコル

1. MIC₉₀ Assaysの複製と非複製の設定について

1. M. tuberculosis、M. bovis BCG、またはM. smegmatisをOD₅₈₀が0.01-0.1で接種し、Middlebrook 7H9-ADN(0.2%グリセロール、0.2%デキストロース、0.5%アルブミン、0.085%NaClを含むMiddlebrook 7H9)または7H9-OADC(0.2%グリセロールと10%OADCサプリメントを含むMiddlebrook 7H9)で中対数相(OD₅₈₀ ~0.5)に拡大します。
2. 結核菌とボビス菌BCGを細胞培養フラスコで~20 mlのスタンディング培養として増殖させ、ポリプロピレン丸底(4 mL培養)または50 mlの円錐遠心チューブ(10-20 mL培養)で振とうしながら、M. smegmatisを培養します。病原性マイコバクテリアを37°Cで20%_O2および5%_CO2でインキュベートし、M.smegmatisを37°Cで20%_O2でインキュベー
トします。
3. 複製条件と非複製条件で最小阻害濃度(MIC90)スタイルの実験を設定します(図1).
   手記：試験剤は通常、96ウェルマイクロプレートあたり4つまたは2つの化合物を試験できるように、重複または4重でアッセイされます。例えば、96ウェルプレートでは、1つの試験剤をA〜D列で、もう1つの試験剤をE〜H列でアッセイできます。DMSO(ビヒクル)はカラム 1、2、および 12 にあり、試験剤の希釈シリーズはカラム 3(最低濃度)からカラム 11(最高濃度)まで続きます。MIC90スタイルのアッセイは、通常、2倍希釈シリーズを採用しています。マイコバクテリアには多数の非複製モデルがあり、説明のために、非複製のマルチストレスモデルを使用しています。
   1. リプレクティングアッセイでは、7H9-ADN中の200 μLの細胞をOD₅₈₀ 0.01で、透明底の組織培養処理済み96ウェルプレートのすべてのウェルに分配します。
   2. 非複製アッセイでは、0.02% チロキサポールを含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で細胞を 2 回洗浄し、非複製培地 (0.05% KH₂PO₄、0.05% MgSO₄、0.005% クエン酸第二鉄アンモニウム、0.0001% ZnCl₂、0.1% NH₄Cl、0.5% BSA、0.085% NaCl、0.02% チロキサポール、0.05% 酪酸; pH を 5.0 に調整、2 N NaOH) で細胞を再懸濁します。
      1. 非複製培地で細胞をOD₅₈₀ 0.1に希釈し、新たに調製した1 MストックからNaNO₂を最終濃度0.5 mMまで添加します。
      2. OD₅₈₀ 0.1 の 200 μl 細胞を、透明底の組織培養処理済み 96 ウェルプレートのすべてのウェルに分配します。
         手記：化合物希釈液を100倍原液としてDMSOに調製します。したがって、最終濃度0.4〜100μg/mlで分子の影響を試験する一般的なMICプレートには、DMSO中の0.04〜10mg/mlのストック溶液が必要になります。
   3. 試験剤1の希釈液2 μlをA-E行目に加え、試験剤2の希釈液2 μlをE-H行目に加えます。よく混ぜます。
   4. 2 μl のビヒクル制御 (通常は DMSO) を制御ウェルの列 1、2、12 (行 A-H) に加えます。よく混ぜます。
   5. 各実験について、0.004〜1 μg/mlのリファンピシン(複製アッセイ)および/または0.08〜20 μg/ml(非複製アッセイ)などの少なくとも1つのポジティブコントロールを含めます。
      手記：6-ブロモ-1H-インダゾール-3-アミン9を0.1〜25 μg/mlで使用することは、非複製のマルチストレスモデルにおいて選択的なNaNO2依存活性を持つコントロール化合物として推奨されます。
   6. アッセイの複製には、マイクロプレートを37°Cで20%_O2および5%CO₂で7日間(M.tuberculosisおよびM.bovis BCG)または1〜48時間(M.smegmatis)インキュベートします。非複製のマルチストレスモデルでは、マイクロプレートを 37 °C で 1% O₂ および 5% CO₂ (M. tuberculosis および M. bovis BCG) で 7 日間インキュベートします。

>2. CARAマイクロプレートの接種

1. CARAをリードアウトとして使用する時点で、50〜75μlに設定されたp200マルチチャンネルピペットを使用して、MIC90スタイルのアッセイプレートのウェル内容物を慎重に再懸濁し、少なくとも5〜10回上下にピペットし、ピペットチップを使用してウェル内容物を円を描くように静かに回転させます。
2. 10 μlのアッセイウェル内容物をCARAマイクロプレートに移します。アッセイプレート上のウェル内容物の順序が、CARAマイクロプレートのウェル内容物の順序と一致していることを確認してください。移載中の飛散を避け、10 μlがCARAマイクロプレートウェルの中央にスポットされていることを確認してください。10 μlがCARAマイクロプレートに吸収されることを確認します.
   手記：CARAマイクロプレート上の細胞を見つける前に希釈する必要はありません。
3. CARAマイクロプレートのスタックをプレートテープで縛り、再封可能なビニール袋に入れます。CARAマイクロプレートを20% O₂(M. smegmatis)または1% O₂および5% CO₂(M. tuberculosisおよびM. bovis BCG)を用いて37°Cでインキュベー
トします。
4. M. tuberculosisおよびM. bovis BCGの場合、複製アッセイ:7日間インキュベート、M. tuberculosisおよびM. bovis BCG非複製アッセイの場合、10日間インキュベート、M. smegmatisの場合、複製アッセイの場合、1〜2日間インキュベート、M. smegmatis、非複製アッセイの場合、2〜3日間インキュベートします
   注:時間は推定値であり、さまざまな反復条件、非反復条件、および応力条件に応じて変更される場合があります。

3. CARAマイクロプレートの開発

1. CARAマイクロプレートは、細菌の増殖の膜、またはより大きな巨視的なコロニーがネガティブ(ビヒクル)コントロールウェルに見える場合に開発します。
   手記：長時間のインキュベーション後、CARAマイクロプレートウェルは乾燥しているように見えることが多く、ウェル内容物を滅菌PBSで事前に湿潤させることをお勧めします。これにより、木炭がレサズリンを吸収するのを防ぐのに役立ち、蛍光の低下や井戸間のばらつきにつながる可能性があります。
2. 12個のp200チップの1セットとマルチチャンネルピペットを使用して、ウェルの側面に沿って40 μlの滅菌PBSを分注し、PBSが寒天/細菌マイクロコロニーの上部に分布
するようにします。
3. 5 mgのレサズリン(0.01%最終)と50 mlの5%Tween-80をPBSに混合して、CARA現像試薬を調製します。ボルテックスおよび滅菌フィルター.
   手記：代替のCARA現像試薬は、市販のレサズリン液体溶液を1:1(vol/vol)でPBS中の10% Tween80と混合することで調製できます。
4. 調製したばかりのCARA現像試薬50 μlを、12チャンネルピペットを使用してCARAマイクロプレートの各ウェルに加えます。岩板を数回前後に動かして、各ウェルの寒天とバクテリアマット全体に試薬を分散させます。
5. プレートを再封可能なビニール袋に入れ、37°CでM.smegmatisの場合は少なくとも30分間、M.tuberculosisまたはM.bovisの場合は45〜60分間インキュベートします
   手記： ビヒクル制御ウェルが最初の1時間以内にピンク色に変わらなかった場合は、プレートを再袋に入れて、より長い時間インキュベートすることができます。
6. 蛍光を読み取る前に、CARAマイクロプレートをバイオセーフティフードに室温で15分間入れ、蓋を外します。バイオセーフティキャビネットの外でBSL3分光光度計を使用する場合は、光学品質のPCRステッカーをプレートに貼り付け、柔らかいペーパータオルでステッカーの表面を優しく押してしっかりと密封します。
7. 530 nmの励起と590 nmの発光でトップリードを介して蛍光を測定します。プレートをブランクにする必要はありません。

結果

図1:ブロスMIC₉₀アッセイとCARAの概略図と予想される結果。 MIC₉₀ と CARA の両方の結果が、8 つの可能な活動について提示されます。MIC₉₀ マイクロプレートウェルの色分けは白 (成長なし) と茶色 (成長なし) で、CARA マイクロプレートは黒 (蛍光なし) とピンク (レゾルフィン蛍光) です。データは架空のものです。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ミドルブルック7H9	ベクトン・ディキンソン	271310
ミドルブルック7H11	ベクトン・ディキンソン	298810
ミドルブルックOADC	ベクトン・ディキンソン	212351
BSA、ヒートショック	ロシュ	3118958001
活性炭	シグマ
PBS、ダルベッコのCa2+およびMg2+フリー	ライフテクノロジー / Invitrogen	14190-144
トゥイーン 80	シグマ	P8074
リファンピシン	シグマ	R3501
6-ブロモ-1H-インダゾール-3-アミン	アルファ・アエサル	H34095-J
リン酸カリウム一塩基性	シグマ	P0662
硫酸マグネシウム、七水和物	シグマ	M1880
クエン酸第二鉄アンモニウム	シグマ	F5879
硫酸亜鉛、七水和物	シグマ	Z0251
塩化アンモニウム	シグマ	A9434
酪酸, 液体	シグマ	B103500
レサズリン粉末	シグマ	R7017
塩化ナトリウム	J.T.ベイカー	4058から01
調製したレサズリン溶液	インビトゲン	DAL1100
分光 光度 計	分子デバイス	M5
96ウェル、組織培養処理済みマイクロプレート	コーニング	3595
試薬リザーバー	VWRの	89094から678
再封可能なビニール袋	VWRの	〒395-94602
14 mL ポリプロピレン丸底チューブ	コーニング	352059
50 mLコニカル遠心チューブ	コーニング	352070
75 cm2 細胞培養フラスコ	コーニング	431464ユー

型 の の の 名 さん