1. CARエンコードレンチウイルスの生成
>注:特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞プラスミドの構築が完了すると(CD47など)、レンチウイルスCARは、293FT細胞、レンチウイルスパッケージングミックス、およびトランスフェクション剤(材料の表を参照)を使用して、標準的な手順で生成されます。その後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)キットとサーマルサイクラー(材料表を参照)を使用して、製造元のプロトコルに従ってレンチウイルスRNAの量を測定することにより、ウイルス力価を決定します。すべてのレンチウイルス処置は、安全要件に厳密に従って実施することが重要です。
- 15 x 106 HEK293FT細胞をダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で播種し、加湿した5%二酸化炭素(CO2)インキュベーター内の1つの150 mmディッシュで細胞を37°Cで一晩インキュベートします。
- トランスフェクション複合体を含む2本の15 mLチューブを調製します。最初のチューブには、レンチウイルスベクタープラスミドDNA(5 μg)とレンチウイルスパッケージングミックス(22.5 μg)が2.5 mLのトランスフェクション希釈溶液に含まれています。2本目のチューブには、2.5 mLのトランスフェクション希釈溶液に82.5 μLのトランスフェクション試薬が入っています(材料表を参照)。
- チューブ1の内容物をチューブ2にピペットで移し、室温で15分間インキュベー
トします。
- チューブの内容物をHEK293FT細胞の皿に滴下し、加湿した5%二酸化炭素CO2インキュベーターでサンプルを37°Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、既存の培地を19 mLの新鮮なDMEM培養培地と交換し、加湿した5% CO2インキュベーター内で37°Cで細胞を一晩インキュベートし続けます。
- 培地をディッシュから50 mLの遠心チューブに移します。ウイルス含有培地を入れたチューブを冷蔵庫に保管してください。
- 上記の手順を繰り返し、新しいDMEMを追加し、1日後に再度収集します。
- メディアの2つのコレクションを1つの遠心分離チューブに結合します。チューブを2,000 x gで4°Cで30分間遠心分離します。
- レンチウイルス含有上清の大部分を超透明遠心チューブに移します。細胞や破片が含まれている可能性のあるペレットを乱さないように、上清の最小量である約1 mLを残します。.
- 上記で清澄化した上清を110,000 x gで4°Cで100分間超遠心分離します。
- 上清を慎重に取り除き、チューブの底にあるウイルスペレットに100 μLのDMEM培地を静かに加えます。チューブを氷の上に15分間放置します。溶液を穏やかに混合し、レンチウイルス溶液を予冷滅菌チューブに分注します。これらのウイルスストックチューブは、-80°Cの冷凍庫で保管してください。
- 定量的RT-PCRキットを使用して、レンチウイルスRNAを抽出して測定するメーカーのプロトコルに従ってレンチウイルスの力価を決定します。
2. CAR-T細胞の生成と増殖
- 以前に凍結したヒト末梢血単核細胞(PBMC)(約1 x 106〜2 x 106細胞)を、同数のCD3/CD28コーティングマイクロビーズ(材料表を参照)のCAR T細胞培地1 mLで活性化し、加湿した5%CO2インキュベーターで細胞を37°Cで24時間インキュベートします。
- レンチウイルスストックのアリコートを氷上で解凍します。
- 1 μLの形質導入促進剤をウェルに細胞とともに加え、混合します。
- レンチウイルスを5:1の感染多重度(MOI)で細胞に添加し、穏やかに混合します。翌日、このステップを繰り返します(最初の形質導入から24時間後)。
- T細胞の増殖を2〜3日ごとに監視します。新鮮なCAR T細胞培地をさらに追加して、細胞を1 x 106から2 x 106細胞/mLの密度に維持します。
- 凍結溶液を使用した標準プロトコルでCAR-T細胞を凍結します(材料の表を参照)。
- 標準的な方法を使用してCAR-T細胞を解凍し、CAR-T細胞培地でインターロイキン-2、IL-2(300ユニット/mL)を含む約2~4時間前培養してから、アッセイに適用します。
3. フローサイトメトリーによるCAR発現の検出
- 3 x 105 CAR T細胞および非形質導入T細胞を2本の別々の1.5 mL微量遠心チューブに移します。
- チューブを300 x gで2分間遠心分離し、1%ヒト血清を含む200 μLの蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファーに細胞を再懸濁します。
- 100 μLの細胞溶液を2本の5 mLポリスチレンFACSチューブにピペットで移し、チューブを氷上に5分間保持します。
- ビオチン化ヤギ抗マウスF(ab')2 1 μL を各細胞タイプのチューブ 1 本に 1 μL 加えます。次に、PE標識抗タグ抗体であるフィコエリスリン2μL(材料表を参照)を各細胞タイプの他のチューブに加えます。よく混ぜて、氷の上で30分間インキュベートします。
- 各チューブ内の3mLのFACS緩衝液で細胞を洗浄し、チューブを300×gで5分間遠心分離し、上清とボルテックスを非常に短時間廃棄するか、チューブを短時間振とうして細胞を残留液に再懸濁する。
- 2 μL の抗原提示細胞 (APC) 抗 CD3 と 2 μL の 7-アミノアクチノマイシン D (7-AAD) 抗体溶液 (材料表を参照) を各チューブに加えます。抗F(ab')2 Abで染色した細胞のチューブに、PE標識ストレプトアビジン1 μLを加えます。短時間混合し、チューブを氷上でさらに30分間インキュベー
トします。
- ステップ3.5で説明したように、FACSバッファーを使用して細胞を再度洗浄し、各チューブにさらに200μLのFACSバッファーを添加します。
- フローサイトメトリーを使用して細胞を解析するには、まず前方散乱図対側散乱図でT細胞をゲーティングし、次にCD3対7-AADプロットで生細胞(7-AAD陰性)をゲーティングします。最後のステップは、抗タグ、抗ScFv、または抗F(ab')2とCD3の比較を分析することです。
4. リアルタイム細胞溶解力アッセイ(RTCA)
>注:RTCAアッセイは、メーカーの推奨条件に従って行ってください。簡単に言うと、まずEプレートのウェルで標的細胞をプレート化し、次に翌日にCAR-T細胞を添加します。標的細胞に対するCAR-T細胞の細胞溶解活性は、リアルタイムでモニタリングされます。T細胞および模擬形質導入T細胞(Mock CAR T cells)は、ネガティブエフェクター細胞コントロールとして使用されます。以下のプロトコルは、接着性腫瘍細胞株のin vitroリアルタイム細胞溶解力アッセイについて説明しています。
- 100 μL のターゲット細胞培養培地を xCELLigence E-Plate の各ウェルに加え、プレートを xCELLigence 装置内に置き、バックグラウンドを読み取ります。次に、Eプレートを組織培養フードに移し、細胞播種を行います。
- 標準的なプロトコルを使用して、培養デバイスから標的がん細胞をトリプシン化します。次に、細胞を15 mLの遠心チューブに移し、最大15 mLの新鮮な培地を加えます。細胞を200 x gで5分間遠心分離してペレット化します。上清を捨て、5 mLの新鮮な培地を加え、血清ピペットを使用して細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。血球計算盤と顕微鏡を使用して生細胞の密度をカウントします。
- 細胞密度を適切に調整し、Eプレートの各ウェルに100 Lの細胞懸濁液を添加します。標的細胞数は通常、接着細胞株(BxPC3、Hela-CD19、SKOV3)では約10,000細胞/ウェル、Rajiなどの浮遊細胞では約30,000細胞/ウェルです(液体がん細胞をテザリングするための抗体によるウェルのプレコーティングの詳細については、以下を参照)。
- E-Plateを室温で30分間平衡化し、細胞がウェルの底に均一に沈殿するようにします(これは重要です。この手順をスキップしないでください)。
- E-Plateを細胞培養インキュベーター内のxCELLigence装置にセットし、15分ごとに自動的にCell Index vs. Timeとして表示されるインピーダンスの測定を開始します。
- 翌日、エフェクターCAR-T細胞を調製します。適切なコントロール(模擬CAR-T細胞、形質導入されていないコントロールT細胞、および/または無関係のCAR-T細胞)を事前に準備して、すべての細胞が同時に準備ができていることを確認してください。エフェクター細胞とコントロール細胞を適切な密度に調整し、ステップ9で各ウェルに100 μLのエフェクター細胞懸濁液を添加したときに目的のE:T比が得られるように、段階希釈液を調製します。
- xCELLigenceのデータ取得を一時停止し、E-Plateをインキュベーターから細胞培養フードに移します。
- 各ウェルから100 μLの培地を取り出します。各ウェルの残留培地の量は100μLになりました。
- 100 μLの段階希釈エフェクターCAR-T細胞またはその他のコントロール細胞(すなわち、Mock CAR T細胞)を添加して、目的のE:T比を達成します。
- E-Plateを室温で30分間平衡化してエフェクター細胞が沈殿するまで待ってから、E-PlateをxCELLigence装置に戻します。データ取得を再開します。
- 必要に応じて、重要なポイントでxCELLigenceデータ取得を一時停止し、プレートを取り外して、直交アッセイ(つまり、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはフローサイトメトリーによるサイトカイン産生の測定)で分析する小さなサンプルを収集することができます。
- EGFR-GITR-CD3 CAR T細胞実験では、ELISAキットを使用してインターフェロンガンマ(IFNγ)収量を測定します(製造元の指示に従ってください;材料表を参照).
手記液体がんの使用について:非接着性の血液がん細胞を試験するために、細胞を追加する前に、Eプレートのウェルはまず、がん細胞の表面に発現する抗原に特異的な抗体でコーティングされます。Raji B細胞株には、抗CD40に基づくテザリング試薬が使用されます(材料表の液体腫瘍殺傷アッセイキットを参照)。以下は、プレートをコーティングする手順です。
- テザリング試薬(抗CD40)をテザリングバッファーで4 μg/mLの濃度に希釈します。
- 組織培養フード内で作業し、希釈したテザリング試薬50 μLをE-Plateの各ウェルに加えます。E-Plateを室温または37°Cのインキュベーターに3時間放置します。
- テザリング試薬を取り外し、E-Plateを洗浄バッファーで少なくとも2回洗浄します。この時点で、E-PlateはRajiターゲット細胞(30,000細胞/ウェル)を播種する準備ができています。
- 手順 4.1 (上記) に進み、残りの手順を実行します。
