TNFαに対する抗体の抗アポトーシス活性を決定するためのIn Vitro法

要約

出典:Tierrablanca-Sánchez, L., et al.抗TNFモノクローナル抗体(mAb)の相対効力の測定 (an In vitro バイオアナリシス法を用いたTNFの中和によるもの。 J. Vis. Exp. (2017)

このビデオでは、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α(TNFα)に対する抗体の有効性を、 in vitro バイオアナリシスアプローチで評価する技術を示しています。TNFαは、ストレスを受けた細胞に導入されると、アポトーシスを引き起こします。しかし、抗体に結合するとTNFαが閉じ込められ、アポトーシスが回避されます。アポトーシスの程度は、生物発光アッセイを使用して定量化されます。

プロトコル

1. メディアとソリューションの準備

1. 培地を調製します:RPMI-1640と10%ウシ胎児血清(FBS)、pH 7.4。
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結果

図1:アッセイプレート内のサンプルの処分。B1 から G11 はマイクロプレート内のウェル座標であり、サンプル希釈液が配置される位置を示しています。欠落している座標は、コントロールとアッセイ培地(A1-A12およびH1-H12)で満たされたウェルです。このサンプルのランダムな分布(マイクロプレートの順希釈と逆希釈)は、培地やその他の変数の蒸発による結果のバイアスを排除するのに役立ちます。各マイクロプレートは、一度に 1 人のアナリストが行うのが最善です。R:参照、S:サンプル、CS:コントロールサンプル、Dil:希釈。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
WEHI 164	ATCCの	CRL-1751	Mus musculusからの線維肉腫細胞
RPMI-1640 ミディア	ATCCの	2001年30月	培地は2°Cから8°Cで保存
RPMI 1640ミディアム、フェノールレッドなし	ギブコ	11835-030	培地は2°Cから8°Cで保存
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッド	ギブコ	〒25200-056	培地は-10°Cから-20°Cで保存
DPBS、カルシウム、マグネシウム不使用	ギブコ	14190-136	培地は2°Cから8°Cで保存
組換えヒトTNF-αタンパク質	R&Dシステム	210-TA-020	-20°Cから-70°Cで保存
ウシ胎児血清(米国)、超低IgG	ハイクローン	SH3089803	-10°Cから-20°Cで保存
ウシ胎児血清(米国)、特性評価	ハイクローン	SH3007103	-10°Cから-20°Cで保存
Caspase-Glo 3/7 アッセイキット	プロメガ	G8093	Caspase-Glo. 3/7 Substrate および Caspase-Glo. 3/7 Buffer は、光から保護された -20 °C で保管してください
EDTA、二ナトリウム塩、二水和物、結晶、A.C.S.試薬	J.T.ベイカー	8993-01	--
mAbサンプル:アダリムマブ	プロバイオメッド	NAの	マイクロプレートの最終濃度は、0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014、0.004 μg/mL
mAbアダリムマブの参照および制御	アッヴィ	NAの	マイクロプレートの最終濃度は、0.666、0.333、0.167、0.111、0.083、0.056、0.042、0.028、0.014、0.004 μg/mL
マイクロプレートリーダー	分子デバイス	89429-536	SpectraMax M3 マルチモード
マイクロプレートリーダーソフトウェア	分子デバイス	--	SoftMax Pro 6.3 GxP(ソフトマックス プロ 6.3 GxP)
孵卵器	レブコ	30482	Revco RNW3000TABB 強制空気CO2
層流フード	ベイカーカンパニー	200256	ベイカー SG603A-HE |高効率、クラスIIタイプA2

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