1. Naïve MoDCの制作
>注:全血サンプルは、ヘパリン化された気管による頸静脈穿刺によって、単一の病原体のない子牛から採取されました(この研究では8本の9mL血管が使用されました)。血液をアイスボックスで運びます。サンプルは後で使用するために2〜4°Cで保管するか、すぐに処理してください。血液が固まらないように、血液を回転させ続けます。バキュテイナーを70%エタノールで滅菌します。以下の実験はすべて、1つの生物学的サンプルと6つのテクニカルレプリケートで行いました。
- ヘパリン化血液からPBMCを単離するための密度勾配遠心分離
- 血液を10倍反転させてよく混ぜます。
- 10 mLピペットを使用して、20 mLのヘパリン処理血液を滅菌済みの50 mLチューブに移し、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈します。
- 15 mLのリンパ球単離培地を滅菌済みの50 mLチューブにピペットで移します。
手記：リンパ球分離培地を室温まで待ってから、ピペッティングしてください。
- リンパ球分離培地を含む50 mLチューブを45°の位置に傾けます。25 mLピペットの先端を垂直に向け、30 mLの血液PBSをリンパ球分離培地の上に慎重に重ねます。非常にゆっくりと、50 mLチューブを垂直位置に戻します。
- 800 × gで20°C、最大加速、ブレーキなし(減速機能オフ)で35分間遠心分離します。
- パスツールピペットを使用してPBMC層(血漿の最初の層の直後の薄い白い層)を採取し、新しい50 mLチューブに移します
手記：密度勾配遠心分離は、全血を異なる層に分離します。その結果、赤血球はペレットとして下部に沈殿し、単核細胞(PBMC)は界面層に沈殿し、血漿は最上層を形成します。顆粒球は、ペレットとPBMC層の間に見られます。
- 収穫したPBMCを40mLまで加え、ピペッティングで上下させて完全に混合して、収穫したPBMCを2回洗浄します。次に、500 × g、4°Cで7分間遠心分離し、最大加速と最大減速を行います。
- 上清をデカンテーションで捨て、ペレットを15 mLの1x塩化アンモニウム-カリウム(ACK)緩衝液に再懸濁し、室温で10〜15分間インキュベートします
手記：15分以上インキュベートしないでください。市販のACKバッファーは、PBMC画分中に存在する残留赤血球(RBC)の溶解を確実にするために使用されます。
- PBSを40mLまで添加し、その後、500 × g、4°Cで最大の加速と減速で7分間遠心分離します。
- 上清をデカンテーションして捨て、手順1.1.9を繰り返します。
- 上清を捨て、ペレットを10 mLの完全培地(室温)に再懸濁します
手記：完全な培地は、10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMI 1640細胞培養培地で構成されています。
- CD14標識磁気ビーズを用いたPBMC集団からのCD14+/−細胞の磁気分離
- 10 μL の細胞懸濁液と 10 μL のトリパンブルー (0.4%) 溶液を混合したクリーンな血球計算盤セルカウンターで細胞をカウントします。
注:トリパンブルー染料は有毒な化学物質であり、発がん性物質の可能性があります。接触を避けるために個人用保護具(PPE)を着用して取り扱い、廃棄物は密閉された特殊な有毒廃棄物容器に廃棄する必要があります。死細胞は青色で見えますが、生細胞は顕微鏡下で鮮明に見えます。
- 500 × gで7分間遠心分離します。
- ピペットを使用して上清を廃棄し、1 ×10 7細胞ごとに40 μLの容量を使用して、蛍光活性化細胞ソーティングバッファー(FACS)にペレットを再懸濁します。ピペットを使用して完全に混合します.
注:FACS緩衝液は、PBSに溶解した2%FBSと2mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で構成されています。
- 1細胞×10細胞7個につき5μLのCD14マイクロビーズバッファーを加え、ピペットで十分に混合します。
- 4〜8°Cで30分間インキュベートし、ウシCD14+単球を正に選択します。潜伏期間中は15分ごとに渦
巻きます。
- オプションのステップ(フローサイトメトリー解析用):CD14-FITC(フルオレセインイソチオシアネート)染色抗体10 μLを添加し、その後4〜8°Cで15分間インキュベートします。
- 1 mLのFACSバッファーを加え、500 × gで7分間遠心分離します。
- 上清を捨て、ペレットを1細胞×10細胞8細胞あたり500μLのFACSバッファーに再懸濁します。
- 免疫磁性細胞分離カラムをセパレーター(磁気カラムホルダー)に挿入し、フロースルーを回収するためのカラム出口の下に15mLの採取チューブを置きます。
- 脱気したFACSバッファー1 mLでカラムを洗浄します。すすぎ後、使用済みの15mLチューブを新しいものと交換してください。
- 500 μLのバッファーに1個×10個の8個の細胞を一度にピペッティングして、ステップ1.2.8の細胞懸濁液をカラムに通過させます。
手記：セルをカラムに通す前に、セルを混合する際に気泡が発生しないように注意してください。
- 毎回、脱気した3 mLのFACSバッファーでカラムを3回すすいでください。
- フロースルーを収集し、この最初に溶出した画分をCD14−細胞画分(PBMCSからCD14+単球を引いたもの)として標識します。これはナイーブリンパ球画分とも呼ばれます。
手記：CD14−細胞は、抗原パルスMoDCが産生されるまで、完全な培地で維持されます。
- セパレーターから列を取り外します。
- 新しい滅菌15 mLチューブをカラムの下に置いて、廃液を回収します。
- 5 mLのFACSバッファーをカラムにピペットで注入し、すぐにプランジャーを使用して押し込みます。
- フロースルーを収集し、この第2に溶出した画分をCD14+細胞画分として標識します。これは、ナイーブ単球分画とも呼ばれます。
- 回収したCD14+単球に完全な培地を加えて、1 × 106細胞/mL.
手記：溶出したCD14+細胞分画中の生細胞をカウントし、目的の細胞数を達成するために必要な全培地の容量を推定します。
- 滅菌済みの24ウェルプレートを用意し、各ウェルに1 mLの細胞懸濁液(1 × 106細胞/mL)を加えます。
- 合計5日間のインキュベーションで3% w/vサイトカインカクテル(GM-CSF + IL-4)を添加することにより、CD14+ナイーブ単球のナイーブMoDCに分化
- CD14+単球を含む各ウェルに、キットに含まれているサイトカインカクテル40 μL(3% w/v)を添加します。
- プレートを加湿インキュベーターで5% CO2と37°Cで48時間インキュベー
トします。
- 2日目に、各ウェルの含有量の半分(500 μL)をピペットを使用して個々の1.5 mLチューブに移し、500 × g、4°Cで7分間遠心分離します。
- 上清を捨て、ペレットを500 μLの新鮮な完全培地に再懸濁します。
- ステップ1.3.4のこの細胞懸濁液500 μLを指定された各ウェルに戻し、最終容量が1 mLになるようにします。
- 各ウェルを20 μLのサイトカインカクテルで強化します。
- 培養物を加湿インキュベーターで5%CO2および37°Cで72時間インキュベートします。
- 5日目のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出します.
注:各ウェルには、ナイーブMoDCの細胞懸濁液1 mLが含まれます。MoDCの数は、プレーティングされた元の単球(1 × 106 / mL)の割合(~20%)になります。
2. 抗原パルスMoDCの生成
>注:狂犬病ウイルス(RV)に対する市販の臨床的に承認されたワクチンは、ナイーブなMoDCの成熟した抗原提示MoDCへの分化を誘導することができます。1回のRVワクチン接種用量の0.1%(~1μL)を使用して、抗原パルスMoDCを生成します。さらに、ナイーブMoDCを新しい24ウェルプレートに移すと、ナイーブMoDCに悪影響を与えるため、ナイーブMoDCの生成に使用したのと同じ培養プレートでRVパルスMoDCを作製することが好ましい。
- 24ウェルプレート中のナイーブMoDC培養物1 mLにRV懸濁液1 μL/mLを加え、5% CO2および37°Cで48時間インキュベートします
注:RV刺激なしで培養したナイーブMoDCは、バックグラウンドコントロールとして使用されます(および次のステップでリンパ球との共培養のための非特異的刺激として)。
- インキュベーション後、7日目に、抗原パルスMoDCを含む24ウェルプレートを氷上に10分間保持します。
- 1ウェルあたり1 mLの氷冷PBSを加えます。ピペッティングで各ウェルを十分に混合し、懸濁液を15 mLチューブに移します。
- 2 mLの氷冷PBSでウェルを洗浄し、各ウェル内に残った残留細胞を回収します。
- 内容物をそれぞれのチューブに移し、細胞懸濁液を500 × gで7分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、細胞ペレット(抗原パルスMoDC)を完全培地に再懸濁し、最終細胞濃度1×105細胞/mLに容量を調整します
手記：生細胞をカウントして、目的の細胞数を達成するために必要な培地の量を推定します。7日目からのRVパルスMoDCをMoDCリンパ球共培養システム用 。
>3. MoDCとリンパ球の共培養
>注:in vitroのMoDCリンパ球共培養システムは、MoDCが抗原特異的リンパ球をプライミングする能力を決定します。共培養の16日後の細胞のさまざまな処理グループには、特異的、非特異的、およびコントロールが含まれます。特定のグループは、RVパルスMoDCと共培養されたリンパ球として定義されます。非特異的群は、非抗原パルスMoDCと共培養されたリンパ球として定義されます。対照群は、MoDCなしで培養されたリンパ球として定義されます。
- 溶出したナイーブリンパ球画分(CD14-細胞)に完全な培地を添加して、細胞濃度を2 × 106細胞/mLにします
注:CD14-細胞培養中の生細胞をカウントし、その収集以来、24ウェルプレートの全培養培地に保持されている細胞をカウントし、所望の細胞数を達成するために必要な培地の量を推定します。
- 7日目に、滅菌済みの24ウェルプレートを取り、1 mLのナイーブリンパ球細胞懸濁液(2 × 106細胞/ mL)と1 mLの抗原パルスまたは非抗原パルスMoDC懸濁液(1 × 105細胞/ mL)をウェルに播種します
手記：各ウェルの総容量は 2 mL で、ウェルあたりリンパ球に対する MoDC の比率は 1:20 です。
- プレートを37°Cおよび5%CO2で48時間インキュベートします。
- 抗原パルスMoDCによる培養濃縮と再刺激
- 抗原パルスMoDCリンパ球共培養物のインキュベーション後、9日目に、各ウェルに20 ng/mLの組換えIL-2を補充し、さらに120時間(5日間のインキュベーション)インキュベーションを続けます。
- 14日目に、共培養物1 mLを滅菌済みの1.5 mLチューブに移し、500 × gで7分間遠心分離します。
- 上清を捨て、1 mLの抗原パルスまたは非パルスMoDC(1 × 105 cell/mL)で細胞ペレットを再懸濁します。ピペッティングで穏やかに混合し、細胞懸濁液を指定されたウェルに戻します
手記：このステップでは、各ウェルの総容量は 2 mL です。
- 5% CO2および37°Cで48時間インキュベートを続けます。16日目のインキュベーション後、共培養物はフローサイトメトリー、qPCR、およびELISAを用いた解析の準備が整います
手記：MoDCリンパ球共培養の各ウェルに2 mLごとに、1 mLの再懸濁細胞をフローサイトメトリー用に染色し、1 mLをRNA抽出に、両方の上清をELISAに使用します。
>4. フローサイトメトリー解析
>注:サンプルをフローサイトメーターで分析する前に、適切なマーカー/mAbで細胞を染色してください。フローサイトメトリー解析に使用する試薬(染色用mAbおよびアイソタイプコントロール)、キット、装置、およびソフトウェアの詳細については、材料表を参照してください。
- フローサイトメーター染色プロトコール
手記：抗CD14 mAbを使用して、PBMC、ナイーブリンパ球、単球の細胞表面染色を行います(ステップ1.2.6)。ナイーブMoDCの細胞表面染色には、抗CD86特異的、抗CD40特異的、および抗MHC II特異的mAbを使用してください。16日目の共培養からの細胞の細胞表面染色には、抗CD4、抗CD8、および抗CD25 mAbを使用します。細胞内染色には、抗Ki-67 mAbを使用してください。さらに、ネガティブアイソタイプコントロールmAbまたはmAbなし(FMO:蛍光マイナス1)で細胞を染色します。表面マーカーと細胞内マーカーの染色における主な違いは、細胞表面マーカーの場合、生死(L/D)染色またはその他のプロセスの前に、細胞を特定の表面mAbで染色する必要があることです。ただし、細胞内染色はL/D染色後に行うため、細胞内浸透を可能にするためには固定と透過化のステップが必要です。
- ピペットを使用して1 mLの細胞懸濁液を滅菌済みの1.5 mLチューブに移し、500 × g.
で10分間遠心分離します
注:遠心分離後、MoDCリンパ球共培養物からの細胞を処理するときは、ELISA分析のために上清を保存してください。
- ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、15 mLチューブに移します。1 mLのPBSを使用して残留細胞を回収し、これを再懸濁したペレットと組み合わせます。
- 細胞を含む15 mLチューブにPBS10 mLを加え、ピペッティングで混合し、850 x gで7分間遠心分離します。
- 上清を捨て、手順 4.1.3 を繰り返します。
- 上清を捨て、上清をデカントした後に残った残留懸濁液(約180μL)で細胞ペレットを慎重に再懸濁します。
- 細胞懸濁液をV底96ウェルプレートに移し、こぼれないようにウェルを密封します。
- プレートを1,400 × gで5分間遠心分離します。遠心分離後、プレートを廃棄物容器の上でフリックして液体のウェルを空にし、プレートを吸収紙で軽くたたいて余分な液体を確実に除去します。
- ウェルあたり25 μLの表面染色マスターミックスを加え、ピペットで穏やかに混合した後、4°Cで30分間インキュベートします< br />
手記： 1つのウェルの表面染色マスターミックスを調製するには、20 μLのFACSバッファーに2.5 μLの表面mAbを添加します。
- ウェルあたり200 μLのFACSバッファーを添加し、1,400 × gで5分間遠心分離します。遠心分離後、デカンテーションしてウェルの液体を空にし、プレートを吸収紙で軽くたたいて余分な液体を取り除きます。
- ウェルあたり100 μLのL/D染色溶液を添加します。ピペットで十分に混合し、その後、暗所で4°Cで15分間インキュベートします
手記：シングルウェルの場合、0.25 μLのL/D色素を100 μLのFACSバッファーに溶解します。L/D色素は、生細胞と死細胞を区別するのに役立ちます。
- 100 μLのFACSバッファーを添加します。ウェルを蓋で覆い、プレートを1,400 × gで5分間遠心分離します。上清をデカンテーションして捨て、プレートを吸収紙で軽くたたきます。
- 手順4.1.11を繰り返します。
- ウェルあたり50 μLの固定溶液(キットに付属)を加え、ピペットで混合してから、プレートを室温で暗所で10分間インキュベートします。
- キットに付属の1x透過洗浄バッファー(PW)150 μLを加え、ウェルを蓋で覆います
手記：1x PWバッファー10 mLを調製するには、10x permバッファー1 mLを10 mLのdH2Oで希釈します。
- プレートを1,400 × gで4°Cで5分間遠心分離し、上清をデカンテーションして廃棄し、プレートを吸収紙で軽くたたいます。
- 1x PWを200 μL加え、続いて1,400 × gで4°Cで5分間遠心分離します。上清をデカンテーションして捨て、プレートを吸収紙で軽くたたきます。
- 細胞内染色には、ウェルあたり25 μLの細胞内染色マスターミックス(抗ヒトKi-67 mAb)を添加します。よく混ぜ合わせ、プレートを4°Cで30分間インキュベートするか、暗所の氷上でインキュベートします
手記：1ウェルの細胞内染色マスターミックスを調製するには、1x PWの24 μLに1 μLのKi-67 mAbを添加します。細胞内染色マーカーは、16日目の共培養細胞を処理する場合にのみ使用されます。PBMC、ナイーブリンパ球、単球、およびナイーブMoDCのプロセッシング中は、細胞内染色は行われません。
- インキュベーション後、各ウェルに200 μLの1x PWを加えます。ピペットで混合し、1,400 × gを5分間遠心分離します。上清をデカンテーションして捨て、プレートを吸収紙で軽くたたきます。
- 200 μLのFACSバッファーを加え、続いて1,400 × gで5分間遠心分離します。上清をデカンテーションして捨て、プレートを吸収紙で軽くたたきます。
- 細胞ペレットを200 μLのFACSバッファーに再懸濁し、各ウェルの内容物を別々の滅菌フローサイトメーターチューブに移します。ウェルあたり300μLのFACSバッファーを使用して、残留細胞を収集します。これで、細胞はフローサイトメトリー分析の準備が整いました。
- フローサイトメーターでのサンプルの分析
手記：サンプルは、メーカーのマニュアルに従って、フローサイトメーター(488 nm、638 nm、および405 nmレーザーを使用)で分析しました。プロトコルの詳細、トラブルシューティング、およびカスタマイズについては、マニュアルを参照してください。
- サンプルを読み取る前と後に定期的なクリーニング手順を実行します。
手記：機器にチューブをロードしている間、位置をスキップしないでください。
- クリーニングサイクルでは、合計4本のチューブを使用し、最初のチューブにはフロークリーニング試薬を、残りの3本のチューブにはdH2Oを充填します。各チューブには3mLのチューブがあります。洗浄運転中に、前方散乱(FSC)の330 V未満でチューブあたり100,000のイベントを捕捉し、側方散乱(SSC)の265 Vに対して約1分間、中流量でデータを取得します。
手記：クリーニング中に破片や細胞イベントを報告しないでください。これが発生した場合は、クリーニング手順を再度実行してください。サンプルを実行する場合は、データを取得する前にすべてのサンプルが均質な懸濁液中にあることを確認してください。
- サイトメーターを接続して電源を入れるには、タイトルバーの左隅にあるアプリケーションボタンをクリックします。アプリケーションのドロップダウンメニューから「Cytometry」オプションを選択し、「Power On.
」オプションをクリックします。
手記： アプリケーションのドロップダウンメニューから、Openオプションを使用すると、ユーザーは事前にプログラムされたアッセイを参照でき、New Protocolオプションを使用すると、ユーザーは新しいプロトコルを作成できます。
- 最初にネガティブコントロールサンプルをマルチチューブホルダーにロードします。[新しいプロトコル] を選択し、ワークスペース/画面の左側にあるワークリストを確認します。
- ワークリストで、マルチチューブホルダー内のサンプルの位置を定義し、サンプルとプロトコールに識別のための名前を付けます。
- ワークスペースの左側にあるハードウェアパネルから、検出器(FSC、SSC、10 の蛍光範囲)、光電子増倍管の電圧(V)、ゲイン、信号の面積-高さ-幅(AHW)など、複数のパラメーターを調整および選択します
手記：検出器の設定は、実験と使用した機器に基づいて選択されました:FSC-AHW:AHW、V:270、G:5;SSC-AHW:A、V:350、G:10;FL1 (CD8/FITC デキストラン)-AHW: A, V: 400, G: 1;FL2 (CD25/PE)-AHW: A, V: 500, G: 1;FL6 (CD4/Alexa Fluor 647)-AHW: A, V: 700, G: 1;FL7 (Ki-67/Alexa Fluor 700)-AHW: A, V: 625, G: 1;FL9(L / D)-AHW:A、V:425、G:1。
- タイトルバーの下にある機器データ収集コントロールパネルから、検出する流量(中)、時間(5分)、およびイベント(ステップ5.2.8を参照)のオプションを調整します。「Acquire Single」オプションをクリックすると、装置がサンプルを描画/実行し、検出されたイベントのリアルタイムプレビューを表示できます。
- リアルタイムプレビューから、蛍光の閾値(電圧とゲイン)と細胞サイズを調整して、最終的に目的の細胞集団の周囲にゲートを描画し、細胞の破片を排除します
手記：FSCは、サイズに基づいて細胞を区別するのに役立ち、したがって、ユーザーは単球やリンパ球などの免疫系の細胞を区別することができます。単球はリンパ球と比較して大きく、より高いFSC強度を示します。
- 合計で約5,000の生きたMoDC、50,000の生きたリンパ球、および50,000の生きた単球イベントを取得します。
- すべてのパラメータがネガティブコントロールサンプルを基準にして調整されたら、[Stop]をクリックし、プロトコルを保存します。
- 次に、すべてのサンプルをマルチチューブローダーにロードします。ワークリストの各サンプルを定義し、ネガティブコントロールを参照して調整されたパラメータを実験内のすべてのサンプルに適用します。Acquireオプションをクリックすると、実験内のすべてのサンプルを連続して実行できます。
- すべてのサンプルからデータを取得したら、適切なデータ分析ソフトウェアを使用して読み取り可能なデータに保存し、変換して、シーケンシャルなバイパラメトリックおよびモノパラメトリックヒストグラムを生成できます。
