造血ポケットへの血球再接着を評価するための血球障害アッセイ

要約

出典:Petraki, S. et al., Drosophila melanogaster Larvaの血球集団を評価します。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、ショウジョウバエの幼虫の造血ポケットにおける血球の再接着を評価する血球擾乱アッセイを示しています。機械的障害は常在する血球を放出し、循環血球数を上昇させます。回復後、常在する血液細胞の再付着が確認され、可逆性が示されます。

プロトコル

1. 血球出血/スクレイプアッセイ

1. スライドの準備:
   1. タイルスキャン機能のない顕微鏡のオプション1:分析する各幼虫について、顕微鏡の視野観察領域に対応する2 mm四方のパップペンウェルが約5個あるスライドガラスを1つ準備し、それぞれに約5〜10 μlのS2培地を追加します(図1A)。ウェルが乾燥するのを防ぐために、スライドを湿ったチャンバーに保管してください。
   2. タイルスキャン機能付き顕微鏡のオプション2:分析する各幼虫について、それぞれ~3 - 4 mm四方の3〜4本のパップペンウェルを備えたスライドガラスを1枚調製し、各ウェルに約15〜20 μlのS2培地を追加します(図1B)。ウェルが乾燥するのを防ぐために、スライドを湿ったチャンバーに保管してください.
      手記：上記の推奨ウェル数は、幼虫あたり最大3,000個の血球(後期2^番目の幼虫、~2.5〜3 mmの長さ、幼虫の血液細胞の大部分を標識する導入遺伝子)に十分です。より大きな血球数を評価する場合、過密を避けるためにより多くのウェルが必要になる場合があります。
2. 幼虫のコレクション:
   1. 幼虫の入ったハエの入った小瓶に水を噴射し、幼虫をペトリ皿に流すか、幼虫の入った餌をペトリ皿にすくい取り、噴出ボトルを使用して水で希釈します。
   2. 絵筆を使用してペトリ皿から幼虫をそっと摘み取り、キャビティ皿の水に入れるか、冷たいブロックのスライドに置きます。
      手記：幼虫は、水中または冷たいブロックで限られた時間保管できます。幼虫の死や血球への望ましくない影響を避けるために、45分以内に検体を使用してください。
3. 解剖：
   1. 冷たい金属ブロックの上の蛍光顕微鏡で幼虫を選択します。必要に応じて、サイズと画像幼虫を測定します。
   2. 循環血球の単離(「出血」):
      1. 幼虫を選択したら、最初のPap-penウェルに1匹の幼虫を入れます(図1C、2A)。
      2. 2本のきれいな針または解剖はさみと鉗子を使用して、幼虫の後端と前端の両方に切開を行います。常在する血球を乱さないように、幼虫の腹側にこれらの切開を行うのが最善です。一貫した結果を得るには、すべての幼虫の同じ位置に切開を行います。^1匹目の幼虫の場合、1回の切開(腹側前方)で十分です。
      3. 幼虫が圧力や物理的な動揺なしに数秒間出血するのを待ちます(図2A).
         手記：複数の幼虫に取り組む場合は、次のステップに進む前に、サンプルの完全性に影響を与える可能性のある幼虫を氷上に長く保持しないように、それぞれにこれらの切開を行うことをお勧めします。
      4. 針または鉗子で幼虫をそっと持ち上げ、2番目のウェルに浸して、残っている循環血球を洗い流します。その後、常在する血球の放出に続きます。
   3. 常在性血液細胞の単離(「スクレイプ」):
      1. 幼虫を次のウェルにそっと移します(図2C)。
      2. 通常、幼虫の前端から約1/3の位置にあり、幼虫の体壁を介して背側に蛍光を発する可能性のある幼虫のリンパ腺を特定します。穿刺を避けるために、リンパ腺のできるだけ近くに針で幼虫を固定することにより、常在性の血球を放出しながらリンパ腺を避けます(図2C)。
         手記：正常な発育中、リンパ腺血球の成熟は幼虫の血球に比べて遅れ、分化した血球の蛍光レポーターは若い幼虫のリンパ腺でシグナルを示さないことがあります。これらの例では、リンパ腺血球による分化蛍光標識幼虫血球の汚染が予想されないため、リンパ腺にあまり注意を払う必要はありません。
      3. 掻き取りおよび/またはジャブの解剖過程で常在する血液細胞を放出します。1つの針先を使用して、リンパ腺の近く(上記参照)または必要に応じて他の体の領域に幼虫を効果的に固定します。別の針を使用して、幼虫の体壁から見える血球のクラスターをジャブします(図2C、E)、血球を分離することを目的としています。血球は、掻き取る動作で放出することもできます。ただし、表皮を早期に引き裂くと、血液細胞の大きなクラスターが放出される可能性があり、自動カウントがより困難になる可能性があります
         手記：幼虫の年齢と遺伝子型に応じて、総血球の数は異なります。上記の放出プロセスを複数のウェルに分散させることで、一部のウェルが血球で過密になり、シングルセル画像解析が困難になるのを防ぎます。
      4. 最終的な死体に残っている血球が少ない場合は、顕微鏡で観察し、手動の集計カウンターを使用してこれらの血球をカウントします(図2E)。カウントを容易にするために、カーカスを同じスライドのきれいな領域に置き、できるだけ薄く広げて光学面の数を減らします。
      5. 解剖が完了したら、細胞が沈殿する(必ずしも付着する必要はない)まで5〜10分待ってから、ウェルをイメージングします。乾燥を避けるために湿ったチャンバーでスライドをインキュベートし、沈殿した血球を乱す可能性のあるスライドの乱暴な取り扱いを避けてください.
         手記：血球数を決定するとき、放出された細胞は固定されておらず、細胞は解剖後すぐに、できれば幼虫から放出されてから30分以内に画像化する必要があります。培地の体積と細胞の特性にもよりますが、大多数の細胞は5〜10分以内に沈殿しますが、これはウェル内の培地の光学面を通して焦点を合わせることによって確認する必要があります。しかし、この時までにスライド表面に付着した血液細胞はごく一部であり、このプロトコルを細胞固定ベースのアプローチに修正する場合は、この事実を考慮する必要があります。
4. 定量化：
   1. 蛍光顕微鏡で沈降した血球の画像を撮影します(図2B、D、F)。続いて、ImageJソフトウェアを使用した血球の定量
   化を行います。
   2. ImageJ細胞計数アルゴリズム用の画像を準備します。
      1. ImageJを使用して井戸の画像を開きます:ファイル→→を開きます(ファイルを見つけて選択します)。
      2. イメージが 8 ビットまたは 16 ビットであることを確認します。画像のしきい値を調整するには、[画像] を選択し、[調整] をクリックして [しきい値] を選択します。「Threshold」ウィンドウを確認します(図3A)。
      3. 「暗い背景」オプションをオンにします。「赤」を選択し、画像内の各セルが赤い点でマークされるまで、下限しきい値レベル(黒い矢印を参照)を上げます(覆われていないセルはグレースケールで表示されます。図 3B)。下限しきい値を上げると、一部のセルがマークされなくなります。これは、下限しきい値をどこまで設定するかの指標になります。
         手記：場合によっては、セルのクラスターを解決できず、パーティクルカウンターによって1つとしてカウントされます。このような場合、クラスター内のセルの数は、画像を調べ (必要に応じて拡大)、集計カウンターを使用して手動でカウントすることで推定できます。あるいは、Lower Thresholdを大きくして、セルのクラスターを解決することもできます。この操作によって生じたマークされていないセルは、タリーカウンターを使用してカウントできます。
   3. ImageJを使用してセル番号を解析します。
      1. Particle Analyzerを起動して、細胞をカウントします(図3C)。[Analyze] を選択し、[Analyze Particle] をクリックします。必要に応じて、[Overlay Outlines] を選択して、アルゴリズムがカウントするパーティクルを確認します (図 3D)。あるいは、アルゴリズムがカウントするユニット(セル、セルの塊など)のサイズまたはピクセル領域に制限を設定します。
      2. [OK] をクリックします。カウントが表示されたサマリー ウィンドウを確認します (図 3E)。

2. 血球障害アッセイ

1. 血球を乱すには、幼虫を選択し、約0.5 gのガラスビーズ(212〜600 μm)を入れた2 mlの微量遠心チューブに入れ、0.5 mlの水を加えます。.
2. チューブを手で、速度10で1分間ボルテックスします。
3. 微量遠心チューブの内容物をペトリ皿にこぼし、絵筆で幼虫を摘み取ることにより、ガラスビーズから幼虫を回収します。
4. 回復段階では、幼虫を事前に準備したペトリ皿に少量のフライフードを入れます。幼虫が45分間または必要に応じて血球パターンを再確立するのを待ちます。
   手記：動きを止めた幼虫は、その過程で死んだため、廃棄します。ただし、通常、1分間の渦巻きの後、損傷はほとんど見られません。
5. 回復期間後、上記のセクション1で説明したように、ブリード/スクレイプアッセイを続行します。

結果

図 1.血球出血/スクレイプおよび擾乱アッセイのセットアップと概略図。(ア)シングルイメージスライドセットアップ:5倍対物レンズでのイメージング用に5つの2mm正方形 (B)タイルスキャンスライドセットアップ:タイルスキャン顕微鏡で≤2.5mm幼虫のブリード/スクレープをイメージングするための4つの3mm正方形。(C) Bleed/Scrape Assay の概略図とImageJを使用した結果としての定量化 (D) Disturbance Assayでは、ガラスビーズで幼虫をボルテックスすることにより、血球パターンが機械的に破壊されます。幼虫は、血球が造血ポケットに再付着する45分間で回復することが許可されます。血球の接着特性は、この方法で評価でき、擾乱後の循環中の血球の割合を定量化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
6cm/9cmシャーレ			評価する遺伝子型ごとに1つ
水噴出ボトル
金属スプーン/ヘラ
細い絵筆			例:「ライナー」
ガラスキャビティ皿
PAPペン:スーパーPAPペンIM3580	ベックマン・コールター
スライドガラス			各スライドには、5つ以上のPAP PEN正方形が描かれています。正方形のサイズは、顕微鏡カメラのイメージング対物レンズと倍率によって異なります。例:2mmの正方形。
モイストチャンバー			これは、スライドやウェルが乾燥するのを防ぐために使用されます:側面/底部に濡れたペーパータオルを敷いた密閉容器
Schneider's Drosophila 細胞培養培地	インビトゲン
コールドブロック			これは、氷の入ったバケツで冷やされた金属ブロック(別名加熱ブロック)であり、できれば黒色または他の暗い反射しない色
針付き1mlシリンジ2本(27G 1/2)	ベクトン・ディキンソン		解剖用。
オプション:サージカルスプリングハサミ(刃先2mm)	ファインサイエンスツール
ガラスビーズ、212-600ミクロン	シグマ
2 mlエッペンドルフチューブ	エッペンドルフ		評価する遺伝子型ごとに1つ
ボルテックスミキサー	フィッシャーサイエンティフィック
蛍光標識付き血球を持つトランスジェニックショウジョウバエの幼虫。適切な導入遺伝子には、HmlΔ-DsRed(Makhijani et al., 2011)、MSNF9mo-mCherry(徳角他, 2009)、BcF6-CFPおよび-GFP(Gajewski et al., 2007)、またはHmlΔ-GAL4(Sinenko and Mathey-Prevot, 2004)、Pxn-GAL4(Stramer et al., 2005)、He-GAL4(Zettervall et al., 2004)、Crq-GAL4(H. Agaisse et al., 2005)、またはUAS-GFPまたは他の蛍光タンパク質導入遺伝子と組み合わせたeater-GAL4(徳澄他, 2009)が含まれます。
蛍光解剖顕微鏡	ライカ		こちら:ライカM205、カメラ、イメージングソフトウェア、測定モジュール付きオプション
カメラアタッチメント付き倒立型蛍光顕微鏡	ライカまたはキーエンス		タイルスキャン機能の有無にかかわらず(例:ライカDMIシリーズ、キーエンスBIOREVO BZ-9000シリーズ)

です