SIV特異的CD8+メモリーT細胞を解析するためのペプチド-MHC-I四量体染色技術

要約

出典:Gonzalez-Nieto, L., et al. ペプチド-MHC-Iテトラマー染色によるアカゲザルのサル免疫不全ウイルス特異的CD8⁺ T細胞の解析。 J. Vis. Exp. (2016年)

このビデオでは、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体クラスI(pMHC-I)四量体を使用して、サル免疫不全ウイルス(SIV)に特異的なCD8⁺メモリーT細胞を特徴付ける方法を示しています。pMHC-I四量体は、SIV特異的ペプチドに結合し、蛍光色素に結合した4つのMHC-I分子の複合体です。これらの四量体は、SIV特異的CD8⁺ T細胞上のT細胞受容体(TCR)に選択的に結合し、これらの細胞の特性評価を容易にします。

プロトコル

1. PKIの扱い

>注:これはオプションですが、Mamu-B * 017:01テトラマーに推奨されます。

1. PBMCをR10培地に1.6×10⁷細胞/mLの濃度で再懸濁します。
2. この細胞懸濁液50 μlを対応するフローサイトメトリーチューブに加えます。各チューブに100 nMのPKI溶液50 μlを加えます。
3. 各チューブを渦巻きにします。37°Cで30分間インキュベートします。このステップの終わりまでに、各チューブには、8.0 x 10⁵ PBMCと50 nMのPKIを含む細胞懸濁液が100 μl含まれているはずです。
4. pMHC-Iテトラマー染色ステップに進みます。

2. 蛍光色素標識pMHC-Iテトラマーによる染色

1. pMHC-Iテトラマーマスターミックスを調製する前に、pMHC-Iテトラマーチューブを20,000 x gで4°Cで少なくとも15分間遠心分離します。このステップの目標は、バックグラウンド染色を増加させる可能性のあるpMHC-Iテトラマー溶液中のタンパク質凝集体をペレット化することです。遠心分離ステップが完了したら、タンパク質凝集体が蓄積するチューブの底部からのピペッティングは避けてください。
2. すべての実験チューブを染色するのに十分なpMHC-Iテトラマーマスターミックスを準備します。ピペッティングエラーを考慮して、このマスターミックスの総容量の15%を超えるものを調製します。
3. pMHC-Iテトラマーを染色バッファー(Brilliant Stain Bufferなど)で希釈し、各試験に25 μlのpMHC-Iテトラマーマスターミックスを添加します。
   1. PBMCを、試験ごとに2つのpMHC-I四量体で標識し、1つはアロフィコシアニン(APC)に結合し、もう1つはブリリアントバイオレット(BV)421に結合させます。
4. 8.0 x 10⁵ PBMCを対応するフローサイトメトリーチューブに最終容量100 μlで添加します。細胞が上記のPKI処理を受けた場合、このステップですでに100μlに再懸濁されているはずです。
5. 25 μlのpMHC-Iテトラマーマスターミックスを対応するフローサイトメトリーチューブに加えます。このステップの終わりまでに、各チューブの最終容量は125 μlになるはずです。
6. 細胞懸濁液を均質化するために、各チューブをボルテック
スします。
7. 暗所で室温で45分間インキュベートし、この45分間のインキュベーション中に表面染色モノクローナル抗体(mAb)カクテルを調製します。

3. 表面染色

1. すべての実験チューブを染色するのに十分なmAbマスターミックスを調製します。ピペッティングエラーを考慮して、このマスターミックスの総容量の15%を超えるものを調製します。
2. ステインバッファー入りマスターミックスの容量を調整し、テストごとに50 μlが添加されるようにします。
3. 非CD8⁺ T細胞を適切に排除し、メモリーサブセットを描写するために、表面染色マスターミックス中の以下の分子に対して滴定した量のmAbを使用してください
   手記： 各mAbに結合した蛍光色素は、参照として提供されます:CD14 BV 510、CD16 BV 510、CD20 BV 510、CD8α BV 785、CD28 PE Cy7、およびCCR7 FITC。CD14、CD16、およびCD20に対するモノクローナル抗体は、「ダンプ」ゲートに含まれるため、同じ蛍光色素(すなわちBV 510)に結合されることに注意してください。
4. 表面染色マスターミックス中の死細胞を識別するための固定可能な色素[すなわち、アミン反応性色素(ARD)]を含めます。ARD試薬が、「ダンプ」ゲートで使用されているものと同様の発光スペクトルを持つ蛍光色素に結合していることを確認してください。この場合は、ARD Aquaをご使用ください。
5. 3.1-3.4に記載されている染色マスターミックス50 μlを、対応するフローサイトメトリーチューブに加えます。このステップの終わりまでに、各チューブの最終容量は175 μlになるはずです。
6. 各チューブを渦巻きにします。暗所で室温で25分間インキュベートします。
7. 細胞を洗浄緩衝液(0.1%のウシ血清アルブミンと0.45 g/L NaN3を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液)で洗浄します
   注意： アジ化ナトリウム(NaN₃)は有毒物質です。微量にもさらされると、症状を引き起こす可能性があります。本物質は、これらの実験を行う機関のEHS(Environmental Health and Safety)Officeが定めるガイドラインに従って取り扱ってください。
8. チューブを510 x gで5分間遠心分離し、上清を別の廃液容器に慎重にデカントします。ペレットを乱さないように注意してください.
   注意：洗浄バッファーの上清を漂白剤を含むリザーバーにデカントしないでください。これは、洗浄バッファーに存在するアジ化ナトリウムと反応して有毒ガスを形成する可能性があるためです。アジ化ナトリウムの処分方法に関するガイドラインについては、これらの実験が実施されている機関のEHSオフィスにお問い合わせください。
9. デカンテーション後、各チューブに保持された残りの液体で細胞をボルテックスします。

>4. 細胞固定

1. 2%パラホルムアルデヒド (PFA) 溶液 250 μl をすべてのチューブに加えて、細胞を固定します
   注意:PFAは有毒物質です。微量にもさらされると、症状を引き起こす可能性があります。本物質は、実験を行う機関のEHS事務局が定めるガイドラインに従って取り扱ってください。
   1. 2% PFA溶液は細胞に対して等張性でなければならないため、PBSを使用してこの溶液を調製します。2%PFA溶液100ミリリットルで、複数回の実験に十分対応できます。細胞凝集体の形成を防ぐために、2% PFAを添加した直後にすべてのチューブを徹底的にボルテックスします。
2. 暗所4°Cで20分間インキュベートします。
3. 手順3.7〜3.9を繰り返して細胞を洗浄します。このステップが完了したら、細胞を4°Cの暗所で24〜48時間保存できます。透過化フェーズに進む前に、チューブを徹底的にボルテックスします。

5. 細胞の透過化

1. 透過処理バッファー500μlを添加します。すべてのチューブをボルテックスします。
2. 暗所で室温で10分間インキュベートします。
3. 手順3.7〜3.9を繰り返して細胞を洗浄します。

>6. 細胞内染色

1. すべての実験チューブを染色するのに十分なmAbマスターミックスを調製します。
2. PBSまたは染色バッファーで容量を調整し、テストごとに50 μlの細胞内mAbマスターミックスが追加されます。
3. CD3およびグランザイムB(Gzm B)に対する滴定量のmAbを使用して、6.1および6.2に記載されているmAbマスターミックスを調製します
   手記： pMHC-IテトラマーによるTCRの関与は、CD3の内在化を引き起こす可能性があり、抗CD3 mAbを表面染色マスターミックスに添加すると、テトラマー+CD3⁺ CD8⁺ T細胞の検出を妨げる可能性があります。これを回避するには、この段階、つまり細胞が透過処理された後に抗CD3 mAbを添加します。各mAbに結合した蛍光色素は、リファレンスとしてリストされています:CD3 PerCP Cy5.5およびGzm B PE。
4. 50 μlのmAbカクテルを対応するチューブに加えます。暗所で室温で30分間インキュベートします。
5. 手順3.7〜3.9を繰り返して細胞を洗浄します。チューブは、フローサイトメーターで取得する準備ができています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ダサチニブ	軸索メドケム	アクソン1392	DMSOに再懸濁し、すぐに-20°Cで保存する必要があります
RPMI w /グルタマックス	gibco/ライフテクノロジーズ	〒61870-036	4°Cで保存する必要があります
熱不活性化FBS	gibco/ライフテクノロジーズ	10082-147	4°Cで保存する必要があります
ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB	ロンザ	17-745E	4°Cで保存する必要があります
DMSO、無水物	ライフテクノロジー	D12345	室温で保存してください。
5 mL 丸底ポリプロピレンチューブ	VWRの	60819-728
蛍光色素標識pMHC-Iテトラマー	NIHテトラマーコアまたはMBL株式会社		4°Cで保存し、維持する必要があります。使用前に20,000 x gで15分間遠心分離してください。凍結しないでください。
蛍光色素標識mAb	さまざまな企業		4°Cで保管および維持する必要があります。凍結しないでください。
LIVE/DEAD フィックス可能 アクア デッドセルステインキット	ライフテクノロジー	L34957	-20°Cで保存し、使用前に各アリコートを50μLのDMSOに再懸濁してください。
ブリリアントステインバッファー	BDバイオサイエンス	563794	4°Cで保存する必要があります
リン酸緩衝生理食塩水	VWRの	97064-158	室温で保存
アルブミンウシ	VWRの	700011から230	4°Cで保存する必要があります
アジ化ナトリウム	VWRの	97064-646	室温で保存してください。有毒物質。漂白剤と混ぜないでください。
ブリーチ	VWRの	89501-620	腐食性の化学物質は、アジ化ナトリウムと混合することはできません。取り扱いには注意が必要です
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡科学	15714-S	可燃性、腐食性、毒性のある試薬。取り扱いには注意が必要です
ポリソルベート20(Tween-20)	アルファ・アエサル	L15029	室温で保存
透過化ソリューション2	BDバイオサイエンス	340973	有毒で腐食性の試薬。取り扱いには注意が必要です
Sarsdet チューブ 1.5mL スクリュートップ	VWRの	72.692.005
2.0ml DNA/RNA低結合チューブ	エッペンドルフ	22431048	滅菌マイクロチューブの使用が推奨されます
ボルテックスミキサー
バイオセーフティキャビネット
Milli Q Intergral純水製造装置	EMDミリポア	ZRXQ010WW	任意のプロバイダーからの分子生物学グレードの水を使用できます
マイクロ遠心分離機
遠心機
4°C冷蔵庫
BD LSR II	BDバイオサイエンス		フローサイトメーターには、使用する染色パネルと互換性のあるレーザーとフィルターが含まれている必要があります。
脱イオン水
アルミホイル	VWサイエンティフィック株式会社	89068-738
孵卵器			37°Cの内部温度を維持できなければなりません
FACS Divaソフトウェア	BDバイオサイエンス
Flowjoソフトウェアバージョン9.6	フロージョ		FACS Divaソフトウェアによって生成されたFCSファイルの解析に使用
マイクロピペットのヒント