白血球と内皮細胞との間の相互作用を研究するための層流ベースのアッセイ

要約

出典:Vajen, T., et al.培養血管細胞および接着血小板上の白血球動員を調査するための層流ベースのアッセイ。J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオでは、白血球と内皮細胞などの細胞パートナーとの相互作用を特徴付ける層流ベースのアッセイを実演しています。この方法は、血管細胞の無傷で合流する層に灌流した場合の白血球の接着、接着解除、および転走に関する動的な洞察を提供します。

プロトコル

1. 白血球の蛍光標識と灌流(ヒトの場合はPMNまたはTHP-1、マウスフローベースアッセイの場合はRAW264.7または初代マウス単球)

1. 蛍光ラベリング
   1. 白血球(1 x 10⁶/mL)を細胞透過性の緑色蛍光核酸染色剤(1 μM)で標識します。細胞を37°Cで30分間インキュベー
   トします。
   2. 細胞をPBSで300 x gで5分間遠心分離して洗浄し、アッセイバッファーに細胞を0.5 x 10⁶細胞/mL(試験条件あたり5 mL、流量に応じて5 mL)の濃度で懸濁します。
2. フローチャンバーアッセイの準備
   1. 細胞単層への白血球接着には、細胞培養培地を皿から取り出し、フローチャンバーに組み立てます。チューブをシリンジに接続します。固定化された血小板への白血球接着のためには、マイクロスライドをシリンジに接続します。ウォーターバスを37°Cに予熱します。
   2. 灌流シリンジ(50mL)を取り、シリンジホルダーにシリンジを取り付け、ポンプを引き出しモードにします。ポンプ容量を0 mLに設定し、50 mLシリンジの直径を26.70 mmに設定します。
   3. エルボルアーコネクタをチューブの一方の端に接続します。シリンジにルアーロックカプラーを取り付け、エルボールアーコネクター付きのチューブをルアーロックカプラーに接続します。フリーチューブの端をフローチャンバーに接続します。
3. 白血球の灌流と接着
   1. 細胞単層への白血球接着には、細胞培養培地を皿から取り出し、フローチャンバーに組み立てます。チューブをシリンジに接続します。固定化された血小板への白血球接着のためには、マイクロスライドをシリンジに接続します。
   2. 白血球の灌流および血管単分子膜または血小板単分子膜への接着を行うには、2本目のチューブをアッセイバッファーを含む50 mLのコニカルチューブに入れ、チューブに1 mLピペットを充填し、チューブを絞ってフローチャンバーに接続します。
   3. 白血球灌流に先立ち、細胞懸濁液に3 mM CaCl₂および2 mM MgCl₂を添加し、37°Cで5分間インキュベー
   トします。
   4. 細胞を灌流する前にアッセイバッファーを灌流して、チャンバーとチューブから可能な空気を除去します。
   5. チューブの端をしっかりと絞って閉じ、チューブをアッセイバッファーから細胞懸濁液に切り替えて、気泡が閉じ込められるのを防ぎます。最初の細胞が到着するまで、適切な流量/せん断応力で細胞を灌流します。
   6. 適切な流速/せん断応力で細胞を2分間灌流し、逆位相差蛍光顕微鏡(EVOS-FLなど)で2〜6分間のローリング細胞と付着細胞の写真を少なくとも6枚撮影し、デジタルCCDまたはCMOSカメラに接続された100倍の倍率で撮影します
      注:流量/せん断応力は、フローチャンバーの寸法と灌流液の粘度によって異なります。ここで使用されている灌流チャンバーの場合(材料の表を参照):
      τ=η*97.1*Φ
      τ:せん断応力(1 dyn/cm²)
      η:粘度(0.015 dyn * s / cm²)
      Φ:流量(0.67mL/min)
4. 白血球の癒着除去
   1. 接着を解消するには、チューブを絞って細胞懸濁液からアッセイバッファーに切り替え、気泡が閉じ込められるのを防ぎます。
   2. 適切な流速/せん断応力を持つアッセイバッファーを用いて灌流することにより、細胞を剥離します(3.3.7注を参照)。
5. 白血球の転生
   1. 白血球の移行については、十分な量の白血球が付着するまで白血球を灌流します(ステップ3)(~50細胞/視野)。
   2. 白血球懸濁液をアッセイバッファーに置き換えてください。
   3. 37°Cで30〜60分間、10〜15秒ごとにタイムラプスで移動細胞を記録します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
倒立型蛍光顕微鏡(EVOS-FLなど	ライフテクノロジーズヨーロッパ bv
ポンプ例:モデル:210-CE	世界の精密機器	78-9210W
Falcon 35 mm TC処理EasyGripスタイル細胞培養ディッシュ	コーニング	353001
50 mLシリンジ	ベクトン・ディキンソン	300137
シリコーンチューブ	VWRの	〒228-0700
エルボルアーコネクタオス	イビディ	10802
メスルアーロックカプラー	イビディ	10823
フローチャンバー	アーヘン工科大学大学病院	特許DE10328277A1:Baltus T、Dautzenberg R、Weber CPD. Strömungskammer zur in-vitroUntersuchung von physiologischen Vorgängen an Zelloberflächen.2005年。
コラーゲンI型、ラットテール	ライフテクノロジーズヨーロッパ bv	A1048301
組換えヒトTNF-α	ペプロテック	300-01A
ペプチド6用トロンビン受容体活性化剤(TRAP-6)	アナスペック / ユーロジェンテック	24191
SYTO 13 緑色蛍光核酸染色剤	ライフテクノロジーズヨーロッパ bv	S7575
塩化カルシウム二水和物	メルク	102382
塩化マグネシウム六水和物	シグマ・アルドリッチ化学	M2670
マウス単球/マクロファージ RAW264.7	ATCCの	TIB-71
ダルベッコ修正イーグルスミディアム(DMEM)、高グルコース	ギブコ	11965092