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1. ナノ構造作製
- ナノファブリケーションの基板として、直径25mm、厚さ約170μm(No.1.5)のガラスカバースリップを選択します。
- カバーガラスをピラニア溶液(硫酸と過酸化水素の比率3:1)に少なくとも6時間浸し、ピラニアに浸したカバーガラスを大量の超純18.2MΩ脱イオン蒸留水(DDW)で洗浄します
注意：ピラニア酸は有機物と激しく反応するため、取り扱いには細心の注意が必要です。
- 10 nmのクロム薄膜を電子ビーム蒸着によってカバーガラス上に堆積させ、ナノ構造のパターニングおよびイメージング中の電荷効果を回避します。
- 乳酸エチルメタクリレート(MMA_EL6)共重合体からなる二重層レジストの第1層を2,000rpmで45秒間紡錘し、次いで150°Cでベークします。ポリメタクリル酸メチル(950PMMA_A2)の第2層を3,000rpmで45秒間紡ぎ、180°Cでベークします。
- 電子ビームリソグラフィー(EBL)を使用して、25 kVで300 μC/cm2の面積線量で二重層レジストをパターニングします。イソプロピルアルコール(IPA)/メチルイソブチルケトン(MIBK):2/1で現像し、IPAですすいでください。
- 電子ビーム蒸着器を用いて、基板上にTi(5 nm)/Au(80 nm)膜を成膜します。
- 金の堆積後、基板をアセトンに4時間浸して、共重合体の二重層レジストを浮き上がらせます。
- 走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて基板を検査し、ナノ構造の形状とサイズを確認し、CR-7エッチング液を用いたウェットエッチングで基板に残ったクロムをRTで60秒間除去した後、重水素減少水ですすいでください。
- アレイ間の細胞イメージングのためのスペースを確保するために、中心間アレイの間隔を33 μmに設計します。電子ビームライターを使用して、各アレイのナノ構造を20 x 20パターンで300 nmピッチでパターニングします。各チップには、高さ80±2.5 nm、直径70±2.5 nmの標準的なナノ構造寸法の300個のアレイが含まれています。
- 原子間力顕微鏡(AFM)を使用してアレイのサブセットを検査し、サイズと均一性を確認します。
- サポートリング(通常はシリコン製)をUV硬化エポキシを使用してカバーガラスの背面に取り付けます。
2. チップ洗浄と自己組織化単分子膜の応用
- チップの洗浄と再生のために、同じ条件下でチャンバーを5分間洗浄した後、5%水素と95%アルゴンの300mTorr混合物に40Wの電力でプラズマ灰を45秒間
。
- 3:1の比率のSH-(CH2)8-EG 3-OH(SPO)とアミンまたはカルボキシル官能基のいずれかを持つ成分、すなわちSH-(CH2)11-EG 3-NH 2(SPN)またはSH-(CH2)11-EG 3-COOH(SPC)からなる2成分エタノールチオール溶液にチップを浸漬することにより、プラズマアッシング直後に金ナノ構造を官能基化します。
- チップをチオール溶液O / Nに残して、自己組織化単分子膜(SAM)を形成します。
- チップをエタノールですすぎ、窒素ガスで乾燥させます。
- 必要に応じて、官能基化チップを4°Cで最大2週間保存します。
- 使用する準備ができたら、選択したリガンド(下記参照)に応じた化学的性質を使用して、SPNまたはSPC成分をリガンドと反応させます
手記：チップは何十回も再生および再機能化できます。特定のチップは、6か月から1年以上の範囲の期間で使用できます。特定のアレイで測定されたスペクトルは、プラズマアッシングによる再生を繰り返し、その後に生体機能化を行った後、確実に再現されます。
3. 表面機能化と動力学的特性評価
>注:市販のSPR装置の官能基化チップを使用して、リガンドと分析物の間の運動速度定数を特徴付け、SAMの非特異的結合に対する耐性を研究してください。効率的な表面機能化を可能にする幅広い流量とマイクロ流体設計があります。SPRは市販されているので、推奨流量を中心に標準化しました。これらの流量はすべてのSPR機器に共通するものであり、制限的ではないことに注意してください。SPR装置は、すべての機能化を局在表面プラズモン共鳴イメージング(LSPR)チップ上で直接行うことができるため、必須ではありませんが、マルチプレックス装置であるため、LSPRマイクロ流体セットアップはそうではないため、作業負荷が軽減されました。
- セクション2で説明されているように、SAMを使用して市販の裸の金チップを機能化します。
- SPCベースのSAMを使用する場合は、重水素減少水で133 mMの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)と33 mMのN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)の1:1混合物でカルボキシル基を活性化します。
- 活性カルボキシル基を目的の抗体/リガンドと300秒間、流速30 μl/分で結合します。通常は、pH 6リン酸緩衝液中でリガンドを調製しますが、これは分子によって異なります。
- リガンド結合後、0.1 Mエタノールアミンをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)にデアクチベーターステップとして300秒間、30 μl/minの速度で流します。
- 目的の分析種を100 μl/minの流速でさまざまな濃度で導入し、速度論解析ソフトウェアを使用して速度定数を計算します。
- 非特異的結合が問題となる場合は、SPOとSPCまたはSPNの比率を増やします。
4. LSPR一般設定
- 顕微鏡の設定:
- 100 Wハロゲンランプを使用して、ケーラーがサンプルを照らします。光路にロングパスフィルタ(通常は593nmのカットオフ)を使用して、共振シフトに寄与しない波長を排除します(図1)。
- LSPRiのデータ収集には、40倍油浸対物レンズ(1.4 NA)と熱電冷却16ビットCCDカメラを備えた倒立顕微鏡を使用します。
- 顕微鏡の出力ポートにビームスプリッターを配置して、画像とスペクトルを同時に取得します。
- 温度制御された顕微鏡ステージを37°Cに設定し、4時間平衡化します。
- 顕微鏡に追加のインキュベーションアセンブリを組み込んで、CO2濃度と湿度をそれぞれ5%と95%に調節します。
- チップの準備と実装:
- セクション2で説明したように、SPR実験から決定された最適な2-8成分SAM比を使用して、LSPRチップを機能化します。
- 次のように、カスタムメイドのマイクロ流体ホルダーにチップをセットします。チップをアルミニウム製の底部ピースに置きます。このボトムピースとシリコンガスケット、および透明なプラスチック製のトップピースの間にチップを挟みます。4本のネジを使用してclampアセンブリを固定します。
- 典型的なSPCベースのチオールアプリケーションでは、重水素減少水中の133 mMのEDCと33 mMのNHSの1:1混合物を300 μlドロップコートして、SPCチオール成分のカルボキシル基を活性化します。
- 10分間待ってから、10 mM PBSで表面を手動ですすいでください。
- 活性カルボキシル基を目的のリガンド (通常は抗体または抗体フラグメント) と結合させ、300 μl のリガンド溶液を液滴コーティングします。
- 30分間待ってから、10 mM PBSで手動ですすぎます。
- 0.1 Mエタノールアミン300 μlをPBS溶液にチップ上にドロップコートして、非特異的結合を最小限に抑えます。10分待ちます。
- エタノールアミンを0.005%Tween 20(PBS-T20)を含むPBSで洗浄します。
- チップの上にクォーツピースを配置して、メニスカスの変化に関連するデータの変動を減らします。
- チップをPBS-T20バッファーで濡らしたままにして、顕微鏡に取り付けます。
- LSPRチップアセンブリを加熱ステージサンプルホルダーにしっかりと置き、マイクロ流体チューブを取り付けます。
- マイクロ流体チューブをアセンブリとフローバッファー(または細胞研究用の無血清培地)に、定常状態に達するまで取り付けます。
- アセンブリと顕微鏡を少なくとも2時間平衡化させます。
- ジョイスティックを使用してチップを位置合わせし、中央のアレイが分光法用の光ファイバーと位置合わせされるようにします。分光データは、分光計とスペクトル解析ソフトウェアを使用して取得されます。
- 実験中は、ソフトウェアオートフォーカス、Zeiss Definite Focus、または同等のオートフォーカスデバイスを使用して、配列にフォーカスを合わせます。
>5. 9E10ハイブリドーマ細胞からの抗c-myc分泌物のLSPRイメージング
注:この研究に使用したハイブリドーマ細胞株は、抗c-myc抗体を構成的に発現するため、化学的トリガーを必要としません
- ナノ構造をc-mycペプチドで官能基化します。これは、クローン9E10ハイブリドーマ細胞によって分泌される抗c-myc抗体のKD値が1.77nMです。
- ハイブリドーマ細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%抗生物質を含むT75フラスコ内の完全増殖培地で、5%CO2未満で37°Cで培養します。細胞密度を4 × 105細胞/mlに維持します。
- 細胞分泌研究では、T75フラスコから遠心分離により細胞をペレット化し、RPMI-1640無血清培地(SFM)で2回洗浄して分泌された抗体を除去し、細胞密度を4 × 106細胞/mlに調整します。
- 細胞を回収し、生存率をテストしてから、LSPRチップに導入します。
- マイクロピペットを使用して、50 μlの細胞溶液をLSPRチップに手動で導入します。数分後、25〜50個のセルがLSPRチップの表面に付着します。
- マイクロ流体灌流システムを使用して、溶液中の残りの細胞を新鮮なSFMで洗い流します。
- イメージング用のLSPRアレイは、10 μm以内で、細胞と重なっていない
近接しています。
- シグナルが分泌された抗c-myc抗体に特異的であることを確実にするために、抗体が存在するかどうか、および抗体が存在するが、溶液中のc-mycペプチドの飽和濃度の存在によってそれらの結合部位がブロックされた状態で、細胞培養培地を導入します。
- 各ランの終わりに、抗c-myc抗体の飽和溶液(250 nM)でセンサーをキャリブレーションします。これは、センサーの応答を正規化し、各実行の生物機能化プロファイルに基づいてフラクショナル占有率を決定するのに役立ちます。
- 画像アライメントソフトウェアを使用して、X方向とY方向のドリフトを修正します。
