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>1. ウイルス滴定
>注:ウイルスの数と重複の数に応じて、ウェルプレートを次の柔軟性でセットアップできます:(1)ウイルス希釈は、行または列に沿って配置できます(図1)。各ウイルスは、別々の行/列を占める必要があります。(2)ウイルス希釈増分は柔軟ですが、左上隅のウイルス濃度が最も高いものから開始する必要があります。(3)重複数に制限はありません。
- 十分な量のMDCK細胞またはMDCK-SIAT細胞8を96ウェルプレート(200 μl/ウェル)に分注します。細胞を5%CO2で37°Cで2〜3日間インキュベートし、コンフルエンスに到達させます。10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)と抗生物質(100 U/mlペニシリンおよび100 μg/mlストレプトマイシン)を添加したDMEMで細胞を増殖させます。SIAT細胞を5% CO2および1 mg/mLのG418硫酸塩
と共に37°Cでインキュベートします。
手記：希釈係数は、経験と使用する細胞株に依存します。ウイルス接種時には、細胞単層はコンフルエントでなければなりません(すなわち、MDCK細胞には細胞壁や目に見える輪郭がなく、MDCK-SIAT1細胞には密集したレイアウトでなければなりません)。MDCKまたはMDCK-SIAT1細胞のコンフルエントフラスコの継代培養に基づく希釈の例を表1に示します。
- ウェルあたり200μlのウイルス増殖培地(VGM)で細胞を3回洗浄します。マルチウォールプレートウォッシャーを70%EtOHで30分間滅菌し、洗浄前に滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)またはVGMですすいでください。
- VGMを吸引し、すぐに各ウェルに50μlのVGMを加えます。
- 6本の滅菌チューブのそれぞれに900 μlのVGMを添加します (または、試験ウイルスと重複チューブの数によってはそれ以下)。100 μlのウイルスを最初のチューブにピペットで入れ、よく混合し、各希釈のチップを交換しながら順次希釈します。滴定する各ウイルスについて繰り返します.
手記： これにより、ウイルスの希釈度は10-1から10-6になります。
- 96ウェルプレートの複製ウェル (図 1 のカラム 9 および 10) に、最高希釈率 (図 1 の 1 x 10-5) から各ウイルス希釈液 50 μl を添加します。
- プレートを37°Cに2〜3時間置き、ウイルスが細胞に感染するのを待ちます
手記：接種物中のウイルスが単層に到達するのに十分な時間を確保するためには、2〜3時間のインキュベーションが必要です。
- オーバーレイ(10 ml /プレート)
を準備します
手記：オーバーレイは、5 ml の 2x DMEM、トリプシン (最終濃度 2 μg/mL)、1 mg/ml ストック 20 μl、および 5 ml のセルロース コットン リンターで構成されています (材料リストを参照)。
- 接種物を取り除きます。
- オーバーレイ(各ウェルに200μl)を加えます。37 °Cで一晩インキュベートします。乱さずに.
手記：ウイルスの出芽は約4時間後に起こるため、この時間以降はプレートが乱されないことが重要です。
- ウェルからオーバーレイを吸引します。
- 氷冷した4%パラホルムアルデヒドをPBS A(200 μl/well)に添加します。4°Cで30分間、または室温で20分間置く
注:PBS Aは、10 gのNaCl、0.25 gのKCl、1.437 gのNa2HPO4、0.25 gのKH2PO4、および1 Lの蒸留水を含む天然pHリン酸緩衝生理食塩水です(材料リストを参照)
注:パラホルムアルデヒドは吸入すると有害であり、飲み込むと火傷を引き起こす可能性があります。また、発がん性に関する証拠は限られており、皮膚に接触した後に感作を引き起こす可能性があります。
- パラホルムアルデヒドを吸引し、PBS A(200μl/well)でプレートを2回洗浄します。
- プレートは、将来の使用のためにPBS Aに4°Cで保管するか、次の手順に進みます。
- 透過化バッファー(100 μl/well)を添加します。室温で30分間放置します。
- プレートをPBS A(200 μl/well)で2回洗浄します。
- インフルエンザA型に対する最初の抗体であるマウスMAb(ELISAバッファー1:1,000)をウェルあたり50μl加えます。室温で1時間(または4°Cで一晩)振とうしながらインキュベートします。
- ウェルあたり100 μlの洗浄バッファー (0.05% Tween 80 in PBS A, v/v) で3回洗浄してください。洗浄の合間に室温で5分間インキュベートします。または、ウェルあたり300μlを使用してインキュベートせずに3回洗浄します。
- 2つ目の抗体であるヤギ抗マウスIgG (H+L) HRPコンジュゲート (ELISA Buffer中1:1,000) をウェルあたり50 μl加えます。室温で1時間、振とうしながらインキュベートします。
- ステップ1.17の説明に従って3回洗います。
- 基質(50 μl/ウェル)を添加します。室温で30分間、または青色の発育がはっきりと見えるまでインキュベートします。
- 反応を停止するには、プレートをウェルあたり200μlの蒸留水で2回洗浄し、洗浄の間に室温で2〜3分間インキュベートします。
- プレートを風乾し、暗い場所に保管します(アルミホイルで包むなど)。
2. ウイルスの中和
>注:中和アッセイに必要なプレート数を計算します。各プレートには、1つのウイルスと多数の抗血清を収容できます。
>注:抗血清の数と重複の数に応じて、ウェルプレートを以下の柔軟性でセットアップすることができます:(1)血清希釈は、行または列のいずれかに沿って配置することができます（図2)。各血清は、別々の行または列を占める必要があります。(2)血清希釈の増分は柔軟ですが、プレートの左上隅にある最も高い血清濃度から開始する必要があります。(3)重複の数は抗血清の数と釣り合います。重複が多いほど、実験のばらつきを滑らかにするのに役立ちます。(4) VCの数とセル制御(CC)の重複の数は柔軟ですが、別々の行または列に配置する必要があります。VCの重複数は、antiseraの数よりも大幅に多いことが予想されます。
- ステップ1.1〜1.3のように、2日または3日前に細胞単層を準備します。
- プレートの各ウェルに50 μlのVGMを添加します。
- VC と CC には、それぞれ 11 列と 12 列を使用します。1:20受容体破壊酵素(RDE)処理血清50μlをカラム1-10.
の最初の行(A)に加えます。
手記：各ウイルスおよび血清の組み合わせについて、アッセイは二重に行われるので、例えば、1つのプレートに、例えば、5つの抗血清に対して試験された1つのウイルスが含まれてもよい。
- 50 μlを行Aから行H(図2の列1〜10)に移し、行Hから50 μlを廃棄することにより、2倍段階希釈を行います。
- 50 μlの希釈液をCCカラム(図2のカラム12)の各ウェルに添加します。
- CCカラム(図2の列1-11、行A-H)を除くプレートの各ウェルに50μlのウイルスを加えます。
- 37°Cで2〜3時間インキュベートし、接種物を取り除きます。オーバーレイ(200 μl)を各ウェルに加えます。乱さずに37°Cで一晩インキュベートします。ウイルス滴定と同様にプレートを固定して染色します(ステップ1.11-1.22)。
3. 中和の定量化
- 図2aに示すように、フラットベッドスキャナーのスキャン領域にウェルプレートを置きます。L字型の位置制限を使用して、最適で再現性のあるイメージング位置を確保します。
手記：1回のスキャンで2つのウェルプレートをイメージングすることが可能です。
- プレートをスキャンします。
- 「Wellplate Reader」ソフトウェアを実行して、必要なウイルス力価を計算します(図3)。
- 「画像の読み込み」ボタンをクリックして画像を読み込みます。「Global Threshold」の赤いバーをスライドさせて、サンプリングしきい値を調整します。「更新」ボタンをクリックして、効果を確認してください。
- 「中和/滴定の計算」ボックスにチェックを入れます。「Sampling」ボタンをクリックして、ICPを定量化します。プロンプトが表示されたら、「保存」ボタンをクリックしてサンプリング結果を保存します.
手記：サンプリングプロセスの後、「Calculate Neutralization/Titration」ボックスにチェックを入れると、「Neutralization & Titration Calculation」という新しいウィンドウが自動的に表示されます。
- ウェルプレートマップをロードまたは入力します。「Neutralization: Infection Deduction (%)」に閾値(例:50%)を示します。
- 「Neutralization Process」を選択して力価を計算します。力価を確認し、「Save & Close」ボタンをクリックして中和結果を保存します
手記：中和は、VC(図 4 のカラム 11 の平均)に対する、血清の最高希釈と事前定義された ICP の減少(50% または 80% など)の逆数として報告されます。代表的な結果では、ICPを50%削減しました。
