画像ベースのマイクロニュートラル化アッセイを用いたウイルス間の抗原関係の解析

Abstract

出典: Lin, Y., et al. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオでは、インフルエンザA型ウイルスとB型ウイルスの抗原関係を解析するためのイメージングベースのマイクロ中和アッセイを実演しています。これは、ウイルス感染の予防における抗体やその他の治療法の有効性を評価するための定量的かつ視覚的な方法を提供します。

Protocol

>1. ウイルス滴定

>注:ウイルスの数と重複の数に応じて、ウェルプレートを次の柔軟性でセットアップできます:(1)ウイルス希釈は、行または列に沿って配置できます(図1)。各ウイルスは、別々の行/列を占める必要があります。(2)ウイルス希釈増分は柔軟ですが、左上隅のウイルス濃度が最も高いものから開始する必要があります。(3)重複数に制限はありません。

1. 十分な量のMDCK細胞またはMDCK-SIAT細胞8を96ウェルプレート(200 μl/ウェル)に分注します。細胞を5%_CO2で37°Cで2〜3日間インキュベートし、コンフルエンスに到達させます。10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)と抗生物質(100 U/mlペニシリンおよび100 μg/mlストレプトマイシン)を添加したDMEMで細胞を増殖させます。SIAT細胞を5% CO₂および1 mg/mLのG418硫酸塩
   と共に37°Cでインキュベートします。 手記：希釈係数は、経験と使用する細胞株に依存します。ウイルス接種時には、細胞単層はコンフルエントでなければなりません(すなわち、MDCK細胞には細胞壁や目に見える輪郭がなく、MDCK-SIAT1細胞には密集したレイアウトでなければなりません)。MDCKま....

Results

図 1:ウイルス滴定実験におけるウェルプレートのセットアップ例。テストウイルスは、別々の行(AからH)に割り当てられます。カラムは、さまざまなウイルス希釈(1〜12)用に設計されています。2 つのカラムを各ウイルス希釈液の重複として使用しました。スケールバー= 10 mm。

図2:サンプルスキャンシステムの概略図(a)フラットベッドスキャナーのイメージング位置上の96ウェルプレート、および(b)(<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
VGMの	シグマ	D6429、P0781	500 ml DMEM + 5 mlペン/連鎖球菌
PBSのA			ネイチャーpHリン酸緩衝生理食塩水:NaCl 10 g、KCl 0.25 g、Na2HPO4 1.437 g、KH2PO4 0.25 g、および距離水1 L
アビセル	FMC	RC-581Fの	100 mLの蒸留水に2.4 gをマグネチックスターラーで攪拌して溶解し、1時間オートクレーブ滅菌
2x DMEM	ギブコ	21935-028
トリプシン	シグマ	T1426
オーバーレイ(10 ml /プレート):			5 ml 2x DMEM、トリプシン 2 μg/ml 最終濃度、Avicell 5 ml
トリトン X- 100 e	シグマ	T8787	透過化バッファー:0.2%(PBS A中)(v/v)
トゥイーン 80	シグマ	P5188	洗浄バッファー:0.05% Tween 80 in PBS A (v/v)
馬の美容液	PAAラボ株式会社	B15-021	ELISAバッファー:PBS A(v / v)で10%+ Tween 80で0.1%
インフルエンザA型に対するマウスMAb	バイオラッド	MCAの400	1 st抗体:1:1,000 ELISAバッファー
ヤギ抗マウスIgG(H + L)HRPコンジュゲート	バイオラッド	〒172-1011	2 nd 抗体: 1:1,000 ELISA バッファー中
真のBluペルオキシダーゼ基質	KPLの	50〜78〜02	原反:真青色 +0.03% H2O2 g (30% 溶液 1:1,000)
96ウェル平底マイクロタイタープレート	共演者	3596
8チャンネルマルチウォールプレートワッシャーとマニホールド	シグマ	M2656
パーフェクションプレートスキャナー	エプソン	V750プロ	イメージングソフトウェアは、http://www.epson.com/cgi-bin/ Store/support/supDetail.jsp? oid=66134&infoType=Downloadsから無料でダウンロードできます。
ソフトウェア運用環境:LabVIEW	ナショナルインスツルメンツコーポレーション	NI Visionビルダを使用したウィンドウベース	バージョン:LabVIEW2012以降