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1. 細胞の播種と処理
- 付着細胞を75 cm2組織培養フラスコで、5% CO2、37°C、加湿インキュベーターで、問題の細胞タイプに適した培地を使用して培養します。細胞がほぼコンフルエントな細胞層に到達するまで細胞を増殖させます。
手記：LNCaP、HEK293、マウス胚性線維芽細胞(MEFs)、BJ、MCF-7、およびRPE-1細胞用の10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)1640培地を使用してください。
- 細胞を3 mLの37°Cリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で洗浄します。PBSを3 mLの0.25%(w / v)トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)と交換し、加湿インキュベーター内でフラスコを加湿インキュベーターで5%CO2、37°Cで細胞が剥離するまでインキュベートします(2〜5分)。
- 分離した細胞を10%FBSを含む7mLの培地で再懸濁します。0.5–20 μLのピペットチップを使用して、10 μLの細胞懸濁液と10 μL 0.4% Trypan Blueを微量遠心チューブで混合します。同じピペットチップを使用して、計数チャンバースライドにすぐに充填し、自動セルカウンターで細胞をカウントします。
- 10% FBSを含有する培地を用いて、ステップ1.1.2の細胞懸濁液を適当に希釈(下記の注参照)調製し、希釈した細胞懸濁液1 mLを12ウェル組織培養プレートの各ウェル(表面積~3.8 cm2)に無菌法を用いて播種します。5% CO2 を 37 °C で加湿インキュベーターで培養し、所望の細胞密度 (収穫時の 60–90% コンフルエンスなど) に達するまで待ちます。 (
手記：回収時に所望の細胞コンフルエント性が得られる細胞懸濁液の適切な希釈は、細胞タイプによって、また実験的処理の期間とタイプによって異なります。したがって、これは各ケースで経験的に評価する必要があります。
- 播種後2日で処理および回収する実験では、12ウェルプレートの各ウェルに2.5 x 105 LNCaP、HEK293、またはMCF-7細胞、5 x 104 MEF、4 x 105 BJ、または1.5 x 105 RPE-1細胞を播種します。
- 緩く接着する細胞の場合は、問題の細胞タイプに推奨されるコーティングタイプでプレートをコーティングします。LNCaP(およびHEK293)の場合、細胞はポリ-D-リジン(PDL)でコーティングされたプレートを使用します。
- そのためには、滅菌H2O中の500 μL PDLを2.5 μg/mLで各ウェルに添加し、プレートを滅菌環境で室温(20〜25°C)で30分間インキュベートします。PDLを吸引で取り出し、各ウェルを1 mLの滅菌H2Oで短時間洗浄します
手記：通常、ステップ1.2.1は実験的な処理なしで行われます。ただし、RNAiを行う場合は、播種で逆トランスフェクションを開始すると便利な場合があります。
- 条件ごとに重複または三重の井戸で実験的治療を行います。
- 例えば、一般的にオートファジー隔離の効率的な誘導因子であるmTOR阻害剤Torin1を50 nMで細胞に処理したり、アミノ酸を含まないEarle's Balanced Salt Solution(EBSS)培地1 mLで細胞を洗浄して細胞を急性血清およびアミノ酸飢餓にさらし、続いて5%二酸化炭素(CO2)を入れた加湿インキュベーターで37°Cで細胞を1 mLのEBSSでインキュベー
トします。
- 沈降性乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)のバックグラウンドレベルを定義するために、1セットのウェルを未処理のままにします。
- 細胞回収の3〜4時間前に、実験的治療の非存在下または存在下で、隔離後阻害剤バフィロマイシンA1(Baf)を飽和量追加します。加湿インキュベーター内で、5% CO2 を 37°C でインキュベートします。
- LNCaP、HEK293、BJ、MCF-7、およびRPE-1細胞には100 nM Bafを、MEFには10 nM Bafを使用します。
- 持続時間が3〜4時間しかない実験的治療(ステップ1.3.1で例示されているものなど)の場合は、治療と同時にBafを追加します。より長い実験的処理を行う場合は、収穫の3〜4時間前まで待ってから、2μLの500倍濃縮Bafストックを直接培地に加えます。
- Bafを添加した直後にプレートを攪拌して混合します。この時点で、マクロオートファジー阻害阻害剤、例えば、10 mMの汎ホスホイノシチド3-キナーゼ(PI3K)阻害剤3-メチルアデニン(3MA)、または10 μMの選択的PI3KクラスIII阻害剤SAR-405をコントロールとして追加することも推奨されます。
>2. 細胞の採取と電気破壊の準備
- 処理期間の終わりに、培地を吸引で吸引し、200 μLの細胞剥離溶液(37°Cに予熱)を各ウェルに加えます。細胞が剥離するまで37°Cでインキュベートします(通常約5分)。
手記：細胞剥離溶液の代わりに0.25%(w / v)トリプシンEDTAを使用できますが、後者にはDNaseが含まれており、分離した細胞の粘度を下げるのに役立ちます。培地が完全に吸引されている限り、トリプシン-EDTAまたは細胞剥離溶液を添加する前に細胞を洗浄する必要はありません。
- 2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を含む500 μLの室温(20-25 °C)PBS、pH 7.4を各ウェルに加え、細胞塊が見えなくなるまでピペットで再懸濁します。細胞懸濁液を氷上の1.5 mL微量遠心チューブに直ちに移します。
手記：特に明記されていない限り、後続のすべての手順は氷上で実行してください。
- 細胞を400 x gで4°C、5分間遠心分離して沈殿させます。
- 上清を(吸引して)完全に吸引し、細胞ペレットをできるだけ乾燥させます。
- 各チューブに400 μL 10%(w / v)スクロース(超高純度H2O)を加えます。
3. 原形質膜の電気破壊と沈降細胞画分と全細胞画分の分離
- 細胞ペレットをピペットで再懸濁して、ほぼ単一細胞懸濁液を取得し、それを4 mmエレクトロポレーションキュベットに移します。
手記：通常、100〜1,000 μLのピペットチップを使用して、~10〜15回ピペッティングするだけで十分です。
- キュベットを指数関数的減衰波エレクトロポレーターに置き、800 V、25 μF、400 Ωで単一の電気パルスを放電します。これらの設定により、~8 ms のパルスが生成されます。
- 新しいピペットチップを使用して、細胞破壊物を400 μLの氷冷リン酸緩衝スクロース溶液(100 mM一リン酸ナトリウム、2 mMジチオスレイトール(DTT)、2 mM EDTA、および1.75%スクロース、pH 7.5)を含む1.5 mL微量遠心チューブに移し、ピペッティングで短時間混合します。
- オプション:効率的な原形質膜の電気破壊を検証するには、ステップ3.3で希釈した細胞破壊液10 μLを1.5 mLの微量遠心チューブで10 μL 0.4% Trypan Blueと混合します。計数チャンバーに移し、トリパンブルー陽性細胞の割合が>99%であることを確認します。
- サンプルを室温(20〜25°C)で30分間計数チャンバーに放置し、トリパンブルー陽性細胞の割合が>99%のままであることを確認します。
- オプション:電気破壊が過酷ではなかったこと、つまり細胞内小器官を破壊していないことを確認するには、上記のようにステップ1.1〜3.3を実行しますが、より大きな出発物質(~80%のコンフルエントセル層を持つ6ウェルプレートのウェル)を使用し、ステップ2.5で150μLの10%スクロースを使用し、ステップ3.3でDTTを含まない150μLのリン酸緩衝スクロース溶液を使用します。
- 2 mLの遠心分離チューブに、リン酸緩衝液8%(w/v)密度勾配培地(8% Nycodenz、50 mMリン酸ナトリウム、2.2%スクロース、1 mM EDTAなど)の1.2 mL密度クッションの上に、ピペットを使用して希釈した細胞破壊液200 μLを慎重に重ねます。ソフトモード機能付き微量遠心分離機(緩やかな加減速)で20,000 x g、4°C、45分間遠心分離し、チューブを慎重に氷上に置きます。
- 密度勾配培地溶液を拾わないように注意しながら、~200 μL の上部画分のうち 60 μL を慎重に取り出し、新しい微量遠心チューブに移します。
手記：これには、「細胞液」と呼ばれる非常に純度の高いサイトゾルが含まれている必要があります。
- 上記のステップで得られた画分の純度を、標準的な手法と4〜20%グラジエントゲルを用いて、オルガネラ含有タンパク質のウェスタンブロット分析を行うこと
により、試験します。
- 例えば、ステップ3.2の電気ショックがそれぞれリソソーム、ミトコンドリア、または小胞体を破壊していないことを確認するために、カテプシンB、シトクロムc、およびプロテインジスルフィドイソメラーゼのイムノブロッティングを行い、LDHのイムノブロットを実行して、細胞液中の細胞質タンパク質の存在を確認する
。
- 並行して、全細胞破壊溶液から作製したタンパク質抽出物に対してイムノブロッティングを行い、使用した抗体が評価対象のオルガネラ含有タンパク質を検出できることを確認します。
- 各サンプルについて、手順3.1〜3.3を繰り返します。
- 希釈した細胞かく乱液(ステップ3.3で取得)から550 μLを、900 μLの氷冷再懸濁バッファー(50 mM一リン酸ナトリウム、1 mM DTT、1 mM EDTA、および5.9%スクロース、pH 7.5)を含む2 mLの微量遠心チューブに0.5% BSAおよび0.01% Tween-20を添加し、ピペッティングで短時間混合します。
- 18,000 x gで45分間、4°Cで遠心分離し、「沈殿LDH」を含むペレットを作製します。上清を(吸引して)完全に吸引して、ペレットをできるだけ乾燥させます。サンプルを-80°Cの冷凍庫に入れます。
- 希釈した各細胞破壊溶液(ステップ3.3で得られたもの)から150 μLを新しいチューブに移し、サンプルを-80°Cの冷凍庫に入れます。これらのサンプルを使用して、細胞内の「合計LDH」レベルを決定します。
手記：この時点で、実験は必要なだけ一時停止できます。
>4. LDHの抽出とLDH酵素活性の測定
- 「沈殿したLDH」(ステップ3.6から)と「総LDH」サンプル(ステップ3.7から)を氷上で解凍します。
- 1.5% Triton X-405 を含む 300 μL の氷冷再懸濁バッファーを「total LDH」サンプルに加えます (最終的な Triton X-405 濃度は 1% になります)。コールドルーム(4〜8°C)のローラーでサンプルを30分間回転させます。
- 「沈殿LDH」サンプルに1% Triton X-405を含む氷冷再懸濁バッファー750 μLを加え、均質な溶液が得られるまでピペットでペレットを再懸濁します。
- ステップ4.2および4.3のサンプルを18,000 x gで5分間、4°Cで遠心分離し、未溶解の細胞破片を沈殿させます。
- 冷たい65 mMイミダゾール(pH 7.5)/0.75 mMピルビン酸4部と冷たい65 mMイミダゾール(pH 7.5)/1.8 mM NADHの一部を混合して、4°Cで少なくとも3週間安定な作業溶液を得ます。
- ステップ4.4の上清3〜30μLをステップ4.5の作業溶液200μLと混合します。
- LDH濃度が既知の標準試料と比較して、37°Cで340 nmのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(還元型)(NADH)吸光度の低下としてLDH酵素活性を測定することにより、LDHの量を決定します。反応が完了に近づくまで、つまり340 nmの吸光度が時間とともに変化しなくなるまで、吸光度測定を行います。
手記：これは、LDH活性を測定するための古典的な生化学的方法です。現在のプロトコルでは37°Cで反応を行いますが、室温(20〜25°C)でも行うことができますので、手動分光光度法を行う場合はお勧めです。現在のプロトコルでは、ロボットマルチアナライザー装置を使用しており、96ウェルプレートでサンプルと作業溶液を自動的に混合し、20秒ごとに37°Cで340nmの吸光度を3分間測定します。その後、装置ソフトウェアは、既知のLDH濃度の標準とキャリブレーションによって得られた標準曲線と比較した経時的な吸光度測定値の傾きを比較することにより、単位(U)/Lで表されるLDHの濃度を計算します。このアプローチによる検出の線形範囲は 30 〜 1,500 U/L です。また、LDHを測定するためのキットが市販されているものも豊富に存在します。それらのいくつかは、酵素反応を比色または蛍光生成物の生成に結合することに基づいており、UV分光光度法以外の手段による検出を可能にし、他の検出範囲と の比較を可能にします。