結核菌感染モデルに対する薬剤効果評価法

要約

出典:Schaaf, K., et al. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオは、結核菌(Mtb)感染に対する薬の有効性を評価するためのアッセイを示しています。Mtb/マクロファージ凝集体を含むin vitro感染モデルは、in vivo感染を模倣して生成されます。適切な抗生物質を導入すると、その有効性はレスザリンアッセイによってテストされ、薬物濃度が増加する細菌の生存を監視します。

プロトコル

1. 結核菌を発現する緑色蛍光タンパク質の培養条件 mc²6206 (MTB-GFP)

>注:プラスミドpMN437を発現するgfp(緑色蛍光タンパク質)で形質転換した結核菌H37Rv由来の補助栄養生物株mc²6206(ΔpanCD、ΔleuCD)は、このプロトコル全体で使用されます。Mtb-GFP株を非GFP発現野生型株に置き換えることで、研究者が容易に株を入手できるようにすることができます。しかし、gfpの発現は、食作用やMtb/マクロファージ凝集体の形成を視覚的に確認するために望ましいとされています。長期保存のために、Mtb-GFP を 20% グリセロールを添加した完全 7H9 培地(ステップ 1.1 に記載)で -80 °C で凍結しました。

1. 7H9 培地に 10% Middlebrook OADC(オレイン酸アルブミンデキストロースカタラーゼ)、0.02% チロキサポール、24 μg/mL D-パントテン酸、50 μg/mL L-ロイシン、50 μg/mL ハイグロマイシン B を添加して、完全な Mtb-GFP 培地(....

結果

図1:薬剤プレートのレイアウト。 (A)ステップ4で使用したドラッグチャレンジプレートのテンプレート例。これにより、8つの定義された濃度で3重のウェルで2つの薬物を並行して試験することができます。代表的な実験として、リファンピシン(RIF)とモキシフロキサシン(MOXI)をそれぞれ2 μMと2.5 μMから使用しました。(B)スループットスクリーニング用の代替テンプレートも提供されており、1 つの濃度で 58 種類の化合物を試験する可能性を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
7H9	BDディフコ	271310	メーカーの推奨事項に従ってください
ミドルブルックOADC	BDバイオサイエンス	212351
チロキサポール	シグマ	T8761	H2Oに20%原液を調製し、フィルター滅菌します。
D-パントテン酸ヘミカルシウム塩	シグマ	P5710	H2O中に24 mg/mlの原液を調製し、フィルター滅菌します。
L-ロイシン	MPバイオメディカル	194694	H2O中に50 mg/mlの原液を調製し、フィルター滅菌します
ハイグロマイシンB	EMDミリポア	400051	H2Oで200 mg / mlの原液を調製
Nalgene Square PETG メディアボトル	サーモフィッシャー	2019-0030
RPMI 1640 のメディア	ハイクロン	01 SH30027日
ウシ胎児血清	アトランタバイオロジカルズ	S12450H
L-グルタミン	コーニング	MT25005CI
ヘープス	ハイクロン	01 SH30237月
Cytation 3プレートリーダー	ビオテック		あらゆる蛍光プレートリーダーや顕微鏡と交換可能
Gen5ソフトウェア	ビオテック		レザスリン共変換の記録と解析
リファンピシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP2679250	H2O中に10 mg / mlの原液を調製
モキシフロキサシン塩酸塩	アクロスオーガニックス	457960010	H2O中に10 mg / mlの原液を調製
レサズリンナトリウム塩	シグマ	R7017	H2O に 800 μg/mL の原液を調製し、フィルター滅菌します
トゥイーン-80	フィッシャーサイエンティフィック	T164500	H2Oに20%原液を調製し、フィルター滅菌します。

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