結核菌感染モデルに対する薬剤効果評価法

要約

出典:Schaaf, K., et al. A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2017年)

このビデオは、結核菌(Mtb)感染に対する薬の有効性を評価するためのアッセイを示しています。Mtb/マクロファージ凝集体を含むin vitro感染モデルは、in vivo感染を模倣して生成されます。適切な抗生物質を導入すると、その有効性はレスザリンアッセイによってテストされ、薬物濃度が増加する細菌の生存を監視します。

プロトコル

1. 結核菌を発現する緑色蛍光タンパク質の培養条件 mc²6206 (MTB-GFP)

>注:プラスミドpMN437を発現するgfp(緑色蛍光タンパク質)で形質転換した結核菌H37Rv由来の補助栄養生物株mc²6206(ΔpanCD、ΔleuCD)は、このプロトコル全体で使用されます。Mtb-GFP株を非GFP発現野生型株に置き換えることで、研究者が容易に株を入手できるようにすることができます。しかし、gfpの発現は、食作用やMtb/マクロファージ凝集体の形成を視覚的に確認するために望ましいとされています。長期保存のために、Mtb-GFP を 20% グリセロールを添加した完全 7H9 培地(ステップ 1.1 に記載)で -80 °C で凍結しました。

1. 7H9 培地に 10% Middlebrook OADC(オレイン酸アルブミンデキストロースカタラーゼ)、0.02% チロキサポール、24 μg/mL D-パントテン酸、50 μg/mL L-ロイシン、50 μg/mL ハイグロマイシン B を添加して、完全な Mtb-GFP 培地(7H9-C)を調製します。
2. Mtb-GFPのバイアル1本を解凍し、30 mLの角底PETGフラスコに10 mLの7H9-Cを加えます。
3. ロータリーシェーカー(50 rpm)で37°Cでインキュベートします。OD₆₀₀が1.0に達するまで(約5〜8日)、数日ごとに光学密度測定(OD₆₀₀)を行います。
4. 必要に応じて希釈し、培養を継いで、OD₆₀₀を0.2〜1.0に維持します。
5. 感染には、対数成長期(OD₆₀₀ 0.6-1)内で確立されたMtb-GFPの培養物を使用します。塊状の培養を避けるために、Mtb培養フラスコを水浴(130 W;3 x 5 sパルス)で週に1〜2回超音波処理します。

2. THP-1細胞の培養条件

1. RPMI 1640培地に10%熱不活化ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、および10 mM HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)を添加することにより、完全なTHP-1細胞培地(RPMI-C)を調製します。
2. T-75フラスコ内の細胞を37°C、加湿雰囲気5%CO₂でインキュベートします。
3. 血球計算盤またはフローサイトメトリーを使用して細胞を1日おきにカウントし、THP-1細胞を1mLあたり0.1〜0.60万の密度に維持します。

3. MTB/マクロファージ凝集体を生成するための感染プロトコル

1. THP-1細胞調製(96ウェルプレートあたり)
   1. 7 x 10⁶ THP-1 細胞を 250 x g で 5 分間遠心分離し、7 mL RPMI-C に再懸濁します。
2. MTB-GFP調製
   1. 2.8 x 10⁸ Mtb-GFP を 3,200 x g で 3,200 x g で 5 分間遠心分離し、OD₆₀₀ 1.0 = 3 x 10⁸ bacteria/mL の変換を使用して遠心分離します。
   2. RPMI-Cで一度洗浄し、ステップ3.2.1のように遠心分離します。
   3. 7 mL RPMI-Cに再懸濁し、ボルテックスで10秒間
   放置します。
3. 感染症
   注: テンプレートについては、図 1 を参照してください。
   1. 培養液の蒸発を防ぐために、列AとH、列1と12に200 μLの滅菌水を加えて96ウェルプレートを調製します。
   2. バックグラウンドコントロール(ブランク)用のカラム2(B2からG2)に200 μL RPMI-Cを添加します。
   3. 感染するには、THP-1細胞懸濁液(ステップ3.1)にMtb-GFP懸濁液(ステップ3.2)を添加し、ピペッティングでよく混合します。最終的なTHP-1細胞密度は5 x 10⁵ / mLであり、対応する感染の多様性は40です。
   4. THP-1/MTB-GFP懸濁液を25mLのリザーバーに注ぎます。
   5. マルチチャンネルピペットを使用して、残りの96ウェルすべて(B3からG11)に200μLのTHP-1/Mtb-GFP懸濁液を添加します><。 手記：複数の96ウェルプレートを使用する場合は、リザーバーに残っているTHP-1/Mtb懸濁液を定期的に再懸濁して、各ウェルに均一な混合物が追加されるようにします。
   6. 5%_CO2を用いて37°Cで7〜10日間インキュベートします。
   7. 2日ごとに培地を交換するには、各ウェルの上部から100 μLの使用済み培地をゆっくりと取り出し、マルチチャンネルピペットを使用して100 μLの予熱済みRPMI-Cを穏やかに加えます。ウェルを再懸濁したり、ウェルの底にあるMtb/マクロファージ凝集体を乱したりしないでください。
   8. 毎日蛍光顕微鏡(対物レンズの4〜10倍)でウェルを目視検査し、Mtb/マクロファージ凝集体のサイズに注意してください。7〜10日目までに、Mtb/マクロファージ凝集体は、薬効試験(セクション4)に進むのに十分な大きさになるはずです(図2を参照)。
   9. 必要に応じて、明視野フィルターセットとGFPフィルターセットを備えた自動細胞イメージングシステムを使用して96ウェルの画像をキャプチャーし、Mtb/マクロファージ凝集体の形成を記録します
      手記：自動イメージングシステムを利用できない場合は、GFPおよび明視野機能を備えた適切な顕微鏡を使用して、代表的なウェルの画像を撮影できます。

>4. mtb/マクロファージ凝集体由来のmtbに対する薬剤効果を評価するための増殖阻害アッセイ

1. 薬物調製(2つの薬物の三重条件)
   注: テンプレートについては、図 1A を参照してください。
   1. 別の96ウェルプレートで、125 μLの7H9-C培地をB2からG10まで加えます。
   2. ステップ4.2.4の希釈を考慮して、1 mLの7H9-C中に、所望の最高最終濃度の2倍の2倍の2種類の薬物を調製します。
   3. 各薬剤をウェルB11-C11-D11およびE11-F11-G11にそれぞれ250μL加えて、三重治療を行います。
   4. マルチチャンネルピペットを使用して、125 μLをB11-G11からB10-G10に移動させることにより、試験薬を2倍に連続希釈します。各ステップで5回ピペッティングして混合します。
   5. プレート上を125 μLをカラムからカラムへ(右から左へ)移動させ続け、カラム4の後で停止します。
   6. カラム4を混合後、125μLを廃容器に捨ててください。列2と3には、背景(空白)および正の成長制御として使用するための薬物を含めないでください.
      手記：あるいは、図1Bのテンプレートに従って、薬物ライブラリーを試験します。各96ウェルプレートは、1つの濃度で58種類の薬物を収容できます。この薬物プレートは、ステップ4.2.4で半分に希釈されるため、所望の最終濃度の2倍を使用して調製します。
2. 薬物治療:
   1. Mtb に感染したマクロファージ (Mtb/マクロファージ凝集体) を含む 96 ウェルプレートを取り出します。
   2. 関連するすべてのウェル(B2からG11)をマルチチャンネルピペットで慎重にデカントします。まず、プレートを傾けずに150μLを取り出し、次にプレートを傾けてピペットチップをウェルの下端に挿入して残りの培地(~50μL)を取り除きます。Mtb/マクロファージ凝集体は井戸の底に付着しているため、材料が失われることはありません。
   3. 100 μLの7H9-C培地を、Mtb/マクロファージ凝集体を含むプレートのすべての関連ウェル(B2からG11)に静かに加えます。
   4. マルチチャンネルピペットを使用して、薬剤含有96ウェルプレート(ステップ4.1)から100μLをインフェクションプレートの対応するウェルに移します。
   5. 密封されたバッグに入れ、37°Cで3日間インキュベー
   トします。

>5. レサズリンマイクロタイターアッセイによる薬効の定量

1. 最終濃度0.8 mg/mLのH₂Oでレサズリン原液を調製し、0.22 μmの細孔径ポリフッ化ビニリデン(PVDF)メンブレンで滅菌します。
2. レサズリン原液、H₂O、Tween-80(H₂O中の20%溶液)を2:1:1の比率で混合して、レサズリン作業溶液を調製します。最終濃度は 0.4 mg/mL のレサズリンと 5% Tween-80 です。
3. プレートリーダーを使用して、37 °Cで24時間、30分ごとに530 nmの励起と590 nmの蛍光を読み取るプログラムを設定します。
4. マルチチャンネルピペットを使用して、薬剤処理プレート(ステップ4.11)のすべての関連ウェル(B2からG11)に20μLのレサズリンワーキング溶液を添加します。
5. プレートをプレートリーダーに置き、手順5.3.
   で設定したプログラムを開始します 手記：大量のアッセイプレートの処理を容易にするには、37°Cのインキュベーターでアッセイを開発し、24時間ごとに1回の蛍光読み取りを行うだけで十分です。これは、キネティックおよびインキュベーション機能を備えたプレートリーダーにアクセスできないユーザーにも適用されます。

結果

図1:薬剤プレートのレイアウト。 (A)ステップ4で使用したドラッグチャレンジプレートのテンプレート例。これにより、8つの定義された濃度で3重のウェルで2つの薬物を並行して試験することができます。代表的な実験として、リファンピシン(RIF)とモキシフロキサシン(MOXI)をそれぞれ2 μMと2.5 μMから使用しました。(B)スループットスクリーニング用の代替テンプレートも提供されており、1 つの濃度で 58 種類の化合物を試験する可能性を示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
7H9	BDディフコ	271310	メーカーの推奨事項に従ってください
ミドルブルックOADC	BDバイオサイエンス	212351
チロキサポール	シグマ	T8761	H2Oに20%原液を調製し、フィルター滅菌します。
D-パントテン酸ヘミカルシウム塩	シグマ	P5710	H2O中に24 mg/mlの原液を調製し、フィルター滅菌します。
L-ロイシン	MPバイオメディカル	194694	H2O中に50 mg/mlの原液を調製し、フィルター滅菌します
ハイグロマイシンB	EMDミリポア	400051	H2Oで200 mg / mlの原液を調製
Nalgene Square PETG メディアボトル	サーモフィッシャー	2019-0030
RPMI 1640 のメディア	ハイクロン	01 SH30027日
ウシ胎児血清	アトランタバイオロジカルズ	S12450H
L-グルタミン	コーニング	MT25005CI
ヘープス	ハイクロン	01 SH30237月
Cytation 3プレートリーダー	ビオテック		あらゆる蛍光プレートリーダーや顕微鏡と交換可能
Gen5ソフトウェア	ビオテック		レザスリン共変換の記録と解析
リファンピシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP2679250	H2O中に10 mg / mlの原液を調製
モキシフロキサシン塩酸塩	アクロスオーガニックス	457960010	H2O中に10 mg / mlの原液を調製
レサズリンナトリウム塩	シグマ	R7017	H2O に 800 μg/mL の原液を調製し、フィルター滅菌します
トゥイーン-80	フィッシャーサイエンティフィック	T164500	H2Oに20%原液を調製し、フィルター滅菌します。

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