ウイルス感染の抗体依存性増強を調べるためのin vitroアッセイ

要約

出典:Valiant, W. G., et al. A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、ジカウイルス回復期血清を使用してデング熱ウイルス感染の抗体依存性増強(ADE)を測定するアッセイを示しています。このアッセイでは、緑色蛍光タンパク質をコードするデング熱レポーターウイルス粒子(RVP)を使用します。ジカウイルスに対する血清抗体は、RVPと交差反応して複合体を形成します。結合した抗体は、Fc受容体を発現する細胞によるRVPの取り込みを増強し、これはフローサイトメトリーを用いて検出されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 1日目

>注:BSL-2実験室での組織培養に使用される無菌層流バイオセーフティキャビネットで、以下に説明するすべての手順を実行します。

1. 血清サンプルを室温で解凍し、各血清サンプル100μLを滅菌チューブに移します。56°Cで30分間、ウォーターバスまたは温度調整可能なサーモミキサーで熱不活性化します。冷冷RPMI-10(10%ウシ胎児血清を含むRPMI)を使用して、血清サンプルを1:1から1:1,000の範囲の10倍段階希釈します。
2. 10 μLの段階希釈血清サンプルを滅菌96ウェルV底プレートの各ウェルに移します。RPMI-10 は RVP のみで血清サンプルなし、RPMI-10 は RVP のみで血清サンプルなしの 2 セットのコントロールウェルを含めます。各血清サンプルとRPMI-10コントロールを3回に分けてセットアップします。
3. デング熱-1、2、3、4のRVPを-80°Cの冷凍庫から取り出し、37°Cのウォーターバスで解凍します。解凍したRVPをすぐに氷に移します。各血清サンプルにつき約170μLのRVP(10μLのRVPs×3ウェル)の血清希釈(1:1、1:10、1:100、1:1,000)ごとに、RVPのみのコントロールウェルを持つRPMI-10の各々につき、RVPs×3ウェルのRVP10μLをそれぞれ取得します。
4. 10 μL の RVP を、血清サンプルを含む 96 ウェル V 底プレートの各ウェルと、RVP (血清なし) コントロールウェルを備えた RPMI-10 にピペットで移します。RPMI-10のみ(血清サンプルやRVPを含まない)ウェルにRVPを添加しないでください。ピペッティングで5〜10回上下させて十分に混合します。RVPの代わりに10 μLの冷冷RPMI-10を、各冷冷RPMI-10のみ(血清サンプルおよびRVPなし)コントロールウェルに添加します。
5. 96ウェルV底プレートをインキュベーターに移し、5% CO₂の存在下でプレートを37°Cで1時間インキュベートします。96ウェルV底プレートをインキュベートしている間に、バイオセーフティキャビネットの表面を70%エタノールで洗浄し、UVライトを15分間実行します。
6. K562細胞の完全にコンフルエントなT75フラスコをインキュベーターから取り出し、滅菌済みの5 mLピペットを使用して細胞をよく混合し、5 mLの細胞を滅菌済みの15 mLコニカルチューブに移します
   手記：K562細胞はRPMI-10で保持され、1 x 10⁶/mLで継代培養されます。
7. 滅菌済みの15 mLコニカルチューブから10 μLの細胞を取り出し、10 μLのトリファンブルーと混合して細胞数をカウントします。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、15 mLコニカルチューブ内の細胞の総数を決定します。
8. 15 mL の円錐形を細胞と共に ~1,200 x g で 10 分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞を温熱 RPMI-10 で 80,000 細胞/30 μL 培地 (2.66 x 10⁶ 細胞/mL) の濃度で再懸濁します。
9. インキュベーターから96ウェルV底プレートを取り出し(ステップ1.6)、30μLのK562細胞を96ウェルV底プレートの各ウェルに移し、5〜10回ピペッティングして完全に混合します。96ウェルV底プレートをインキュベーターに移し、5% CO₂の存在下でプレートを37°Cで1時間インキュベー
トします。
10. 1時間インキュベートした後、96ウェルV底プレートをインキュベーターから取り出し、~1,200 x gで5分間遠心分離します。遠心分離後、プレートを逆さまにして10%漂白剤の入った容器にウェルから培地をデカントします。
11. 各ウェルの細胞を125 μLの温かいRPMI-10に再懸濁して洗浄し、ピペットで十分に混合し、プレートを~1,200 x gで5分間遠心分離します。プレートを逆さまにして10%漂白剤の入った容器に培地をデカントします。この洗浄手順を2回繰り返します。
12. 洗浄後、各ウェルに100 μLの温かいRPMI-10を加え、ピペットで上下に混合し、5% CO₂の存在下でプレートを37°Cで48時間インキュベー
トします。

2. 3日目

1. 100 μLの細胞と培地/ウェルが入った96ウェルV底プレートをインキュベーターから取り出し、バイオセーフティキャビネットに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの内容物を混合し、細胞と培地を96ウェルU底プレートまたは標識済みの5 mLポリプロピレンチューブに移します。
2. 96ウェルV底プレートの各ウェルを100 μLの1%パラホルムアルデヒド(PFA)含有1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、ステップ2.1で96ウェルU底プレートまたは標識5 mLポリプロピレンチューブの各ウェルに移し、最終濃度0.5% PFA/ウェルまたはチューブを得ます。マルチチャンネルピペットで十分に混合し、プレートをアルミホイルで覆い、インキュベーターに30分間置いて細胞を固定します。
3. 未染色のK562細胞を泳動してフローサイトメーター(例えば、材料表を参照)を調製し、蛍光設定とともにサイド散乱と前方散乱をキャリブレーションします。GFPは細胞から放出される唯一の蛍光であるため、必要な蛍光チャネルはFL1のみです。各サンプルから~30,000–50,000個の細胞を取得します.
   手記：RVPに感染した細胞はGFPの存在により緑色蛍光のみを放出し、他の蛍光チャネルは必要ないため、単一の蛍光を読み取ることができるフローサイトメーターであれば、データの取得に使用できます。

3. データ分析

1. フローサイトメトリーで取得したデータは、任意のフローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して解析します(資料の表を参照)。
   1. FSC-A(前方散乱 – 面積)とFSC-H(前方散乱 – 高さ)に基づいて最初のゲートを設定し、単一細胞を含め、自己蛍光ダブレットを分析から除外します。次に、SSC-A(側方散乱-面積)とFSC-Aに基づいて一重項依存性細胞をゲートし、自己蛍光デブリを排除します。
   2. SSC-AとGFP-Aに基づいて、GFPの発現についてSSC-AとFSC-Aのゲーテッド細胞を解析します。血清およびコントロールサンプルの各希釈に対するGFP+細胞の割合を決定するには、GFP+細胞の周囲にゲートを設定します。
2. 各血清サンプル希釈およびコントロールウェルにおけるGFP+細胞の平均割合を決定するには、トリプリケートウェル中のGFP+細胞の合計割合を3で割ります。
3. 各希釈の血清サンプル中のGFP+細胞の平均割合を、RVP(血清サンプルなし)コントロールウェルを備えたRPMI-10内のGFP+細胞の平均割合で割ることにより、感染の倍率増強を計算します。
4. 倍率増強 (y 軸) と希釈率 (x 軸) をグラフ化し、ANOVA とそれに続く多重比較のためのテューキーの事後検定を使用して統計分析を実行します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DENV 1-4 RVPの	積分分子	RVP-501
K562セル	ATCCの	CCL-243
RPMI(ルプミ)	コーニング	10-040-CV
FBSの	GEのライフシーン	SH 30910.03	RPMI-10の10%FBS
ペニシリン-ストレプトマイシン	MPバイオメディカル	1670049	100 IU ペン/mL、100 ug 連鎖球菌感染症/mL in RPMI-10
ヘープス	チェレグロ	25-060-CL	RPMI-10で0.025M
MEM非必須アミノ酸溶液 (100×)	シグマ	M7145	RPMI-10の1x
ピルビン酸ナトリウム	チェレグロ	25-000-CL	RPMI-10で1mM
L-グルタミン	フィッシャーサイエンティフィック	MT25005CI
滅菌Vボトムプレート	トーマス・サイエンティフィック	333-8001-01V
BDファルコンポリプロピレン5mlFACSチューブ	VWRの	60819-728
非滅菌Uボトムプレート	隼	リファレンス 353910	FACSチューブに代わるハイスループット
5mL、滅菌、血清学的ピペット	デンビル	P7127
200uL 滅菌ピペットチップ	デンビル	P3020 CPSの
20uL 滅菌ピペットチップ	デンビル	P1121
50-200uL マルチチャンネルピペット	デンビル	P3975-8-B型
5-50uL マルチチャンネルピペット	デンビル	P3975-9-B型
20% フォルマデヒド	トウシミス	#1008B
ウォーターバス	サーモフィッシャー	TSCOL35
サーモミキサー	エッペンドルフ	2231000387	熱不活性化のためのウォーターバスの代替手段
CO2インキュベーター	サーモフィッシャー	13-998-213
エタノール	シグマ・アルドリッチ	E7023
液体漂白剤	フィッシャーサイエンティフィック	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar株式会社		フローサイトメトリー解析ソフトウェア
BD FACSDiva 6.1.2	ベクトン・ディキンソン
BD LSR IIフローサイトメーター	ベクトン・ディキンソン
液体漂白剤	フィッシャーサイエンティフィック	NC9724348

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