Toll様受容体シグナル伝達阻害のための生理活性ナノ粒子のスクリーニングアッセイ

要約

出典:Yang, H., et al. 食性免疫細胞の生理活性ナノ粒子のスクリーニングにより、Toll様受容体シグナル伝達の阻害剤を探す。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、Toll様受容体(TLR)シグナル伝達を阻害する可能性のある生理活性ナノ粒子をスクリーニングするためのレポーター細胞ベースのアッセイを示しています。このアッセイでは、ペプチド-金ナノ粒子ハイブリッドと混合したリポ多糖(LPS)を、レポータータンパク質(分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)およびルシフェラーゼ)を発現するレポーターマクロファージに導入します。ハイブリッドによって媒介されるLPS誘導TLR信号の減少は、レポーター信号を測定することによって決定されます。

プロトコル

1. レポーター細胞を用いたTLR4ナノ阻害剤候補のスクリーニング

>注:TLR4シグナル伝達は、MyD88依存性の陸上TRIF依存性経路の両方を利用するため、広範囲のTLRシグナル伝達経路を網羅する主要なターゲットとして選択されています。THP-1-XBlueレポーター細胞は主にNF-κB/AP-1の活性化を調べるために使用され、THP-1-Dual細胞はTRIF依存性シグナル伝達からのIRF活性化に使用されます。

1. スクリーニング前に用量反応曲線を生成することにより、最適なLPS用量を特定します。
   1. 作業用LPS溶液をR10培地で最終濃度0.01〜100 ng / mLに希釈します(log10スケールで希釈します)。プレートデザインをレイアウトし、96ウェル丸底培養プレートで希釈します。各ウェルに希釈後の溶液が最低110μLあることを確認してください。
   2. 真空吸引器を使用して、細胞播種プレートから培地を静かに取り出します。
   3. 希釈プレート(1.1.1)で調製したR10培地を含むLPSを、サンプルのレイアウトに従って培養プレートに移します。プレートを37°C(細胞培養インキュベーター内)で24時間インキュベー
   トします。
   4. 24時間後、上清(80 μL/ウェル)を新しい96ウェル丸底プレートに慎重に移します。これらの溶液に対して比色および/またはルシフェラーゼ発光アッセイを直ちに実施するか、アッセイ開発の4°C(数時間)または-20°C(数日)で保存してください。
      手記：プレートレイアウトの設計は、実験やデータ解析のためにシンプルで明確である必要があります。各条件について、2〜4回の反復を考慮する必要があります。常にネガティブ・コントロール・グループ (LPS ヌル) を含めます。デュアルセルはマクロファージに分化した後のNF-κB/AP-1活性化のバックグラウンドが比較的高いため、NF-κB/AP-1活性化にはTHP-1-XBlue細胞を使用することが推奨されます。ただし、NF-κB/AP-1 と IRF の両方の活性化を報告するためにデュアル セルを使用することは可能です。
2. NF-κB/AP-1活性化のための比色分析法とIRF活性化のためのルシフェラーゼ発光分析法を開発します。
   1. NF-κB/AP-1の活性化を評価するには、各サンプルの上清20 μLを新しい96ウェル平底培養プレートに移し、予熱したSEAP基質溶液180 μLを各ウェルに加えます。プレートを37°Cで1〜2時間インキュベートして、発色させます(ピンクからダークブルー)。プレートリーダーで655nmの吸収を収集します.
      注意：インキュベーション時間は、発色に基づいて変化させることができます(30分から一晩のインキュベーションまで)。発色(O.D >3)の彩度を避けながら、最も暗い色の光学濃度(O.D.)が1を超えるまで待つことをお勧めします。
   2. IRF活性化の分析では、各サンプルの上清10 μLを96ウェルの透明な平底白色プレートに移します。ルシフェラーゼ溶液(50μL)を加え、すぐにウェルで発光をよく集めます
      手記：ウェル間およびプレート間での発光読み取りの一貫性を確保するために、自動注入機能を備えた発光プレートリーダーを使用することを強くお勧めします。基質溶液を手動で注入する場合は、各ウェルのインキュベーション時間と読み取りセットアップが一貫していることを確認してください。
3. 10 ng/mL LPS刺激(1.1に基づく)を用いて、さまざまなペプチド-GNPハイブリッドでスクリーニングアッセイを実施します。レポーターアッセイの開発については、1.2と同じ手順に従います。
   1. 遠心分離法を用いて、ペプチド-GNPハイブリッドをR10培地中で200 nMに濃縮します。20容量のハイブリッド溶液(10 nM)を18,000 x gで30分間遠心分離し、上清を慎重に廃棄します。ハイブリッド(チューブの底部)をチューブに集め、PBSで2回洗浄し、ハイブリッドをR10培地の1つの容量に再懸濁します。
   2. 濃縮ハイブリッドとR10培地を含むLPS(20 ng/mL)を等量混合して、ハイブリッドとLPSの最終濃度をそれぞれ100 nMと10 ng/mLにします。
   3. 培養プレートから培地を取り出し、混合溶液100 μLを各ウェルに加え(各条件で3回繰り返し)、ネガティブコントロール(培地のみ)とLPSコントロール(ハイブリッドなしの10 ng/mL LPS)を含めます。
   4. 37°Cで24時間インキュベートした後、各ウェルの培地をチューブに移し、チューブを18,000 x g、4°Cで30分間遠心分離します。上清(50-80 μL/チューブ)を96ウェル丸底プレートに集め、3.2.
      に記載されているレポーターアッセイを実施します 注意：遠心分離後に上清を廃棄するときは、チューブの底でハイブリッドを攪拌しないでください.
      手記：ステップ1.3.4の遠心分離は、非内部化ナノ粒子ハイブリッドを培地から除去するために非常に重要であり、ハイブリッドと比色/発光測定値との干渉を避けることができます。これは、金ナノ粒子が、そのサイズと凝集に応じて広波長の光を吸収できるためです。

2. 潜在的な候補の抑制効果の検証

>注:スクリーニングからの潜在的な候補者の阻害効果を確認するために、2つのアプローチが採用されています。1つは、一定のハイブリッド濃度(またはその逆)での覚醒剤(LPS)の用量反応を調べることです。もう一つは、イムノブロッティングによってNF-κB/AP-1およびIRF3シグナルの阻害を直接調べることです。

1. アプローチ1では、1.3で説明したのと同じ手順に従って、100 nMのリードハイブリッドと2つのLPS濃度(1 ng/mLおよび10 ng/mL)でレポーターアッセイを実施します。比較のために、不活性なハイブリッド(スクリーニング結果に基づく)をハイブリッドコントロールとして含めます。
2. イムノブロッティングアプローチでは、標準的な実験手順に従ってください。
   1. THP-1細胞をR10培地で培養し、細胞を12ウェル培養プレート(2 x 10⁶細胞/ウェル)に播種し、細胞を50 ng/mL PMAで24時間処理した後、2日間休ませてマクロファージに分化させます。
   2. 細胞分化後、ハイブリッド(100 nM)の有無にかかわらず、10 ng/mL LPSで細胞を経時的(最大4時間)刺激します。さまざまな時点(0、5、15、30、60、120、および240分)で、イムノブロッティング用の細胞ライセートを調製します。非アクティブなハイブリッドをコントロールとして含めます。
   3. IκBα、リン酸化p65、およびリン酸化IRF3のシグナルを調査して、NF-κBおよびIRF3の活性化に対するリードハイブリッドの阻害効果を調べます。内部制御としてβ-アクチンおよび総IRF3シグナルをプローブします.
      手記：シグナル伝達は、レポーター酵素であるSEAPおよびルシフェラーゼの発現(24時間)よりもはるかに速く(数時間で)起こることがよくあります。また、別の検証方法として、試験したハイブリッドの生存率アッセイを24時間後に実施することを強くお勧めします。

3. TLR特異性の評価

>注:リードペプチド-GNPハイブリッドのTLR特異性を調査するために、TLR2、TLR3、TLR5などの他のTLRシグナル伝達経路が試験されます。TLP7、8、および9は、マクロファージではTLR7、8、および9の発現がないため、THP-1由来のマクロファージはこれらのTLRの刺激にうまく応答しないため、除外されます。

1. TLR2(Pam3CSK4)、TLR3(poly I:C)、およびTLR5(フラジェリン)に特異的なリガンドのさまざまな濃度(1 ng/mL〜25 μg/mL)を両方のレポーター細胞由来マクロファージで試験し、1.1および1.2の同じ手順に従って最適な濃度を得ます。
2. リードハイブリッド(100 nM)と各TLRリガンドの混合物を3.1から得られた濃度で細胞処理し、1.3に記載の実験手順に従ってリードハイブリッドの阻害特異性を評価します。非アクティブなハイブリッドを比較用のコントロールとして含めます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
THP-1-XBlueレポーターセル	インビボジェン	thpx-sp	細胞培養の継代を20未満に保つ
THP-1-デュアルレポーターセル	インビボジェン	THPD-NFIの	細胞培養の継代を20未満に保つ
RPMI-1640 (L-グルタミンなし)	GEヘルスケア	02 SH30096月	使用前に37°Cまで温め、サプリメントを加えてR10を完全培います
ウシ胎児血清(適格)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12484028	不活性化熱; RPMI-1640 では 10%
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	02 SH30034月	完全な媒体R10で2 mM
ピルビン酸ナトリウム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11360-070	完全な媒体R10で1 mM
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、1X、カルシウム、マグネシウムなし	GEヘルスケア	02 SH30028月	細胞洗浄および試薬調製に使用
クアンティブルー	インビボジェン	レップQB1	SEAP基板
クワンティリュック	インビボジェン	レップ-QLC2	ルシフェラーゼ基質
ゼオシン	インビボジェン	アント-ZN-1	レポーター細胞のための選択抗生物質
ブラストシジン	インビボジェン	アンチBL-1	レポーター細胞のための選択抗生物質
分子生物学のためのジメチルスルホキシド(DMSO)	シグマル・アルドリッチ	D8418-100ミリリットル	試薬調製に使用
大腸菌K12由来のリポ多糖類(LPS)	インビボジェン	TLRL-EKLPSの	TLR4リガンド
S.チフス菌由来のフラジェリン(FLA-ST)、超高純度	インビボジェン	TLRL-エプストフラ	TLR5リガンド
SpectraMax Plus 384 マイクロプレートリーダー	分子デバイス	該当なし	比色アッセイを読む
インジェクター付きInfinite M200 Proマルチモードマイクロプレートリーダー	テカン	該当なし	luminiscienceを読む
Costar アッセイプレート、96 ウェルホワイト、底が透明で平ら、組織キュラー処理	コーニング共演	3903	発光アッセイに使用

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